基于COX信號通路探討梔黃止痛散對急性痛風性關節炎大鼠的影響*

王洋洋，齊秀春，韓崇濤

1.河南省省立醫院，河南 鄭州 450000； 2.河南省中醫院，河南 鄭州 450000

急性痛風性關節炎(acute gouty arthritis，AGA)是因尿酸鹽沉積在關節囊、滑囊、軟骨及其他組織中引起的關節病變及炎性反應，患者常表現為關節疼痛、腫脹、活動受限，嚴重者可出現關節畸形、肌萎縮，甚至由于長期活動受限導致關節功能永久喪失，嚴重影響患者的生活質量[1]。治療主要以消炎止痛為主，但可使用的藥物較少，同時有不良反應[2]。近年來，中醫藥對關節炎疾病的治療有明顯優勢，單獨或聯合常規西藥治療能夠有效改善患者的癥狀[3-5]。梔黃止痛散為治療關節炎、關節損傷的外用中藥方劑，具有活血化瘀止痛、除濕消腫的功效。研究表明，梔黃止痛散外敷能夠治療痛風性關節炎，減輕患者關節疼痛，改善睡眠質量，聯合體外沖擊波可顯著緩解滑膜炎患者關節腫脹和疼痛，但其作用機制尚不明確[6-7]。本研究通過向大鼠踝關節腔注射尿酸鈉建立AGA模型，觀察梔黃止痛散對AGA模型大鼠的保護作用。

1 材料

1.1 動物75只6周齡SD大鼠，SPF級，體質量180～220 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證號為：SCXK(京)2017-0011。飼養條件如下：室溫(22±2) ℃，濕度(50±10)%，動物房保持12 h12 h光暗循環照明，食水不限。研究方案獲河南省省立醫院倫理委員會批準，倫理批號：HNSLYY2019C010。

1.2 藥物和試劑梔黃止痛散(主要成分為梔子、大黃、乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍、白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏、冰片、麝香，由河南省省立醫院藥學部制劑室提供)。秋水仙堿片(云南西雙版納藥業有限公司，批號：H53021369)；尿酸鈉(美國Sigma-Aldrich公司，貨號：U2875)；白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0015c、E-EL-R0012c、E-EL-R2856c、E-EL-0060c、E-BC-K020-M)；環氧化酶-1(cyclooxygenase，COX-1)、COX-2兔源單克隆抗體(美國CST公司，貨號：9896、12282)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)兔源單克隆抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司，貨號：ab45295]；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(美國Thermo Scientific，貨號：K1622)；蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：AR0146)。

1.3 儀器37140型爪腫測量儀(意大利Ugo Basile)；1703935型轉印電泳儀、1645050型電泳儀電源、1658001型垂直電泳儀、ChemiDoc MP型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；7500型PCR儀(美國ABI公司)；IX53型顯微鏡(日本Olympus公司)；FlexA-200型全波長酶標分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥將75只大鼠隨機選取15只為正常組，其余大鼠均通過踝關節腔注射尿酸鈉建立AGA模型，具體為：大鼠用體積分數10%水合氯醛麻醉后，在右后踝關節處注射50 μL尿酸鈉混懸液(20 g·L-1)，正常組大鼠在相同部位注射50 μL生理鹽水[8]，若大鼠受試關節在1 h內腫脹度≥0.3 mL即認為造模成功，然后將造模成功的大鼠隨機分為模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組。造模后1 h開始給藥，梔黃止痛散組大鼠使用梔黃止痛散(根據關節大小，取適量梔黃止痛散加蜂蜜調勻)攤涂在棉紗上外敷于受試踝關節處并用醫用膠帶固定，每12 h更換一次藥物；秋水仙堿組大鼠灌胃秋水仙堿0.15 mg·kg-1，每天3次；聯合組大鼠在灌胃秋水仙堿的基礎上外敷梔黃止痛散；正常組和模型組大鼠使用淀粉外敷于受試關節，每12 h更換一次。所有大鼠均連續給藥3 d。

2.2 大鼠步態評分造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h觀察大鼠步態變化，并進行分級評分為0級：行走正常，計0分；1級：受試肢體稍微彎曲，輕度跛行，計2分；2級：受試肢體剛觸及地面，中度跛行，計4分；3級：受試肢體離開地面，呈三足態行走，重度跛行，計6分[9]。

2.3 大鼠關節腫脹程度測定在大鼠受試踝關節處做標記，造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h采用爪腫測量儀測量各組大鼠右后踝關節標記以下的容積。

關節腫脹度(mL)=(造模后踝關節容積-造模前踝關節容積)

2.4 大鼠機械縮足反射閾(paw mechanical withdrawal threshold，PWT)測定采用von Frey測試針分別于造模后1 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h測定大鼠PWT值，以此評價大鼠機械性痛覺過敏變化。每次測試前，大鼠先放置于容器中適應15 min，然后使用不同刺激強度的von Frey測試針刺激大鼠受試右后肢足底中部，使針彎曲并持續6～8 s，觀察大鼠后肢縮足反應。若大鼠在刺激時間內出現縮足反應則記為陽性反應，每次刺激間隔時間應大于10 s，找到能引起大鼠50%縮足反應的測試探針，記錄相應的壓力值(g)。

2.5 大鼠血清炎癥和氧化應激因子測定造模 72 h 后，各組大鼠腹主動脈取血并分離血清，按照試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量和SOD活力。

2.6 HE染色觀察大鼠關節組織病理損傷變化處死大鼠，每組隨機取5只大鼠分離其右后肢踝關節，置于體積分數10%福爾馬林中固定，隨后進行脫鈣、組織脫水、制作組織蠟塊、切片，切片厚度為 4 μm。將組織切片置于防脫載玻片上，65 ℃烤片 2 h 后使用二甲苯脫蠟30 min，行HE染色，脫水后用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠關節組織的病理改變。

2.7 Western Blot法檢測大鼠關節組織COX-1、COX-2、PGE2蛋白表達水平每組隨機選取5只大鼠的右后肢踝關節囊，收集關節液、滑膜等周圍的軟組織，冰上研磨，離心取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液提取組織蛋白，BCA法蛋白定量，確定蛋白濃度，將蛋白作變性處理后進行SDS-PAGE電泳，濕轉至PVDF膜，封閉2 h，4 ℃孵育COX-1、COX-2、PGE2一抗(抗體稀釋比例均為11 000)，過夜后洗膜，37 ℃孵育二抗(抗體稀釋比例為11 000)，再次清洗后滴加發光試劑，放入凝膠成像儀中成像，Image J軟件對目的蛋白灰度值進行量化，計算蛋白相對表達量。

蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值

2.8 RT-PCR法檢測大鼠關節組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA表達水平取剩余大鼠的右后肢踝關節囊，收集關節液、滑膜等周圍的軟組織，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提總RNA，根據試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA并進行后續反應。采用2-△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

3 結果

3.1 各組大鼠步態變化比較造模后1 h，模型大鼠的步態均不正常，步態評分均為所有時間點最高值。正常組大鼠有輕微跛行現象，模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠右后足彎曲，跛行現象明顯，個別大鼠呈現三足步態；造模后6 h，正常組大鼠步態恢復正常，但其余四組大鼠仍存在明顯跛行現象，隨著時間推移，各組大鼠步態逐漸趨于正常。與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠步態評分顯著降低，其中聯合組恢復最快，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠步態評分比較

3.2 各組大鼠踝關節腫脹程度比較造模后1 h，各組大鼠踝關節均出現腫脹現象，其中正常組大鼠踝關節有輕微紅腫，模型組、秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠踝關節處紅腫明顯。造模后6 h，與正常組比較，其余四組大鼠踝關節仍存在明顯腫脹(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠踝關節腫脹度減輕(P<0.05)。隨著時間推移，各組大鼠踝關節腫脹均逐漸恢復正常，其中聯合組大鼠踝關節腫脹度減少最顯著，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠踝關節腫脹度比較

3.3 各組大鼠PWT值比較造模后1 h，與正常組比較，其余各組大鼠PWT值均降低(P<0.05)。造模后6～72 h，模型組、秋水仙堿組和梔黃止痛散組大鼠PWT值均有所回升，與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠PWT值顯著升高，其中，聯合組PWT值高于秋水仙堿組和梔黃止痛散組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠PWT值比較

3.4 各組大鼠血清炎癥和氧化應激因子水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量顯著升高，SOD活力顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量均顯著降低，SOD活力顯著升高(P<0.05)；與秋水仙堿組比較，聯合組IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量降低，SOD活力顯著升高(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠血清細胞因子水平比較

3.5 各組大鼠關節組織病理變化比較正常組大鼠關節組織正常，偶見炎癥細胞；模型組大鼠關節組織滑膜增生，滑膜細胞數量增加，同時有大量炎癥細胞向滑膜組織浸潤；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠關節組織雖有纖維增生，但炎癥細胞向滑膜組織的浸潤明顯減輕。見圖1。

圖1 各組大鼠關節組織病理變化比較(HE染色，×400)

3.6 各組大鼠關節組織COX信號通路蛋白表達水平比較與正常組比較，模型組大鼠關節組織COX-2、PGE2蛋白表達均升高(P<0.05)，COX-1表達無顯著差異(P>0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠關節組織COX-2、PGE2蛋白表達均降低，COX-1表達無顯著差異(P>0.05)；與秋水仙堿組比較，梔黃止痛散組大鼠關節組織COX-1、COX-2、PGE2蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，聯合組大鼠關節組織 COX-2、PGE2蛋白表達降低(P<0.05)，COX-1表達無顯著差異(P>0.05)。見圖2，表6。

表6 各組大鼠關節組織COX信號通路蛋白表達水平比較

注：A.正常組；B.模型組；C.秋水仙堿組；D.梔黃止痛散組；E.聯合組

3.7 各組大鼠關節組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA水平比較與正常組比較，模型組大鼠關節組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達均顯著升高(P<0.05)，COX-1mRNA表達無顯著差異(P>0.05)；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠關節組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，COX-1mRNA表達無顯著差異(P>0.05)；與秋水仙堿組比較，梔黃止痛散組大鼠關節組織COX-1mRNA、COX-2mRNA、PGE2mRNA表達無顯著差異(P>0.05)，聯合組大鼠關節組織COX-2mRNA、PGE2mRNA表達均降低，COX-1mRNA表達無顯著差異(P>0.05)。見表7。

表7 各組大鼠關節組織COX信號通路mRNA表達水平比較

4 討論

AGA是由于嘌呤代謝紊亂導致血尿酸水平升高，尿酸鹽結晶沉積于關節腔引起的關節紅腫熱痛的急性炎癥反應[10-11]。中藥在治療AGA具有多成分、多靶點和多通路的治療優勢[12-13]。梔黃止痛散由梔子、大黃、乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍、白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏、冰片、麝香等中藥組成。梔子和大黃可消腫散結、破瘀通脈；乳香、沒藥、木香、姜黃、赤芍可活血化瘀、消腫止痛；白芷、天花粉、白蘞、赤小豆、黃柏除濕利水消腫；冰片、麝香芳香走竄，引藥入病所，用蜂蜜調和藥粉，外敷患處，全方共奏行氣活血、化濕利水、清熱消腫之功效。臨床研究證明，梔黃止痛散對關節炎癥性疾病具有較好的療效，并可協同其他療法改善患者癥狀，但其作用機制尚不清晰[14-15]。本研究通過建立大鼠AGA模型觀察梔黃止痛散對AGA大鼠關節腫脹與疼痛的改善作用，并初步探究其作用機制。

研究結果顯示，秋水仙堿和梔黃止痛散均能降低AGA模型大鼠步態評分，減輕踝關節腫脹，提高PWT值，而秋水仙堿和梔黃止痛散聯合的效果優于單藥，初步表明梔黃止痛散對大鼠急性關節炎關節腫脹和疼痛具有一定的改善作用，并可協同提高西藥療效。氧化應激和炎癥反應是AGA的重要病理變化過程，兩種反應相輔相成，互相誘導，是加快疾病發展的重要因素[16-18]。IL-1β是IL-1的主要存在形式，可與滑膜細胞及內皮細胞上的受體結合，介導細胞因子轉錄，刺激單核-巨噬細胞等大量分泌IL-1、IL-6及TNF-α等因子并沉積于關節，誘發炎癥反應[19-20]。研究表明，風濕性關節炎患者外周血與關節液中IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子異常升高，可能參與了風濕性關節炎的發生發展[21]。研究認為，血清IL-6、IL-1β、TNF-α等細胞因子的表達水平對藥物治療類風濕性關節炎的療效具有一定程度的預測作用，IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達下調代表著藥物治療的有效性[22]。另一方面，在正常情況下，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生受到體內SOD等抗氧化劑的控制，但在關節炎中這種氧化劑和抗氧化劑的平衡失調，ROS可破壞關節組織中的脂質、蛋白質和DNA，MDA的含量增加[23-25]。本研究發現，秋水仙堿和梔黃止痛散可降低AGA模型大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA含量，提高SOD活力，二者聯合的抗炎和抗氧化應激作用更顯著，提示梔黃止痛散可顯著抑制AGA大鼠的炎癥反應和氧化應激損傷，與西藥聯合應用有增效作用。病理結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠關節組織有明顯滑膜增生和炎癥浸潤；與模型組比較，秋水仙堿組、梔黃止痛散組和聯合組大鼠關節組織雖有纖維增生，但炎癥細胞向滑膜組織的浸潤明顯減輕，表明梔黃止痛散可顯著改善急性關節炎大鼠關節組織病變。

環氧合酶(COX)由兩種同工酶組成，即COX-1和COX-2。COX-1主要存在于胃、腎、血管等組織，有保護胃腸道黏膜、調節腎血流量的作用，與COX-1不同，COX-2的表達主要由機體炎癥反應如TNF、IL-1β等細胞因子的刺激引起，PGE2是其主要代謝產物，可進一步加速炎癥反應的發展[26-27]。研究表明，IL-6/COX-2軸的激活加重了急性類風濕性關節炎的發展[28]。研究發現，下調COX-2可拮抗膠原誘導型大鼠關節炎的關節腫脹和疼痛反應[29]。本研究發現，AGA模型大鼠關節組織COX-2、PGE2 蛋白和mRNA表達水平均升高，而秋水仙堿和梔黃止痛散可降低COX-2、PGE2 蛋白和mRNA表達，其中梔黃止痛散聯合秋水仙堿的作用優于單藥治療，表明梔黃止痛散單獨或聯合西藥治療可抑制AGA大鼠COX信號通路的活化。

綜上所述，梔黃止痛散單獨和聯合西藥治療均可改善AGA模型大鼠步態、踝關節腫脹和疼痛，減少炎癥和氧化應激反應，減輕受試關節組織病理損傷變化，其作用可能與抑制COX信號通路的活化有關。