花椰菜高效CRISPR/Cas9基因編輯技術體系的構建

楊迎霞 葛賢宏 孫德嶺 金慶東 陸國清 姚星偉

摘? ? 要：CRISPR/Cas9基因編輯技術已經在許多農作物上成功應用，實現了許多重要農藝性狀的精準改良。本研究參考甘藍型油菜（Brassica napus L.）遺傳轉化體系，以花椰菜（Brassica oleracea L.var .botrytis）育種材料‘FQ-36為受體，以花青素合成關鍵基因BoANS為目標基因，構建CRISPR/Cas9表達載體，建立了農桿菌介導的花椰菜基因編輯技術體系，并獲得22株再生植株，經PCR檢測發現13株為轉基因陽性株，轉化效率為59.09%。與野生型相比，3株陽性株花球表面紫色呈現不同程度的消退，初步說明BoANS被成功編輯?；ㄒ薈RISPR/Cas9基因編輯技術體系的建立對后續開展基因功能研究和目標性狀精準改良具有重要意義。目前該技術體系正在應用到花椰菜優異資源的創制中。

關鍵詞：花椰菜;甘藍型油菜;CRISPR/Cas9;基因編輯

中圖分類號：S565.4? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2022.04.002

Construction of Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology System in Cauliflower

YANG Yingxia1， GE Xianhong2， SUN Deling1，3， JIN Qingdong2， LU Guoqing1， YAO Xingwei1，3

（1.Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China; 2.College of Plant Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan， Hubei 430070，China; 3.Tianjin Key Laboratory of Vegetable Genetics and Breeding， The State Key Laboratory of Vegetable Germplasm Innovation， Tianjin 300384，China）

Abstract： CRISPR / Cas9 gene editing technology has been successfully applied in many cropsand achieved the accurate improvement of important agronomic traits. Referred to the genetic transformation system of Brassica napus L.， the CRISPR/Cas9 expression vector was constructed of key anthocyanin biosynthesis gene BoANS and introduced intothe breeding material'FQ-36' of Brassica oleracea L. var. botrytis. The Agrobacterium mediated gene editing technology system in cauliflower was established. As a result， 22 regenerated plants were obtained and 13 （59.09%）positive strains were obtained by PCR detection.Particularly，the purple color on the curd surface of the three plants faded in varying degrees compared to the wild type. The established CRISPR / Cas9 gene editing technology system in cauliflower will be of great significance for subsequent gene function research and accurate genetic improvement.The genome editing technology system in cauliflower is been applying successfully to create cauliflower wonderful breeding materials.

Key words： cauliflower; Brassica napus; CRISPR/Cas9; genome editing

花椰菜（Brassica oleracea L.var .botrytis）又名花菜、菜花，屬于十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種，其味道鮮美、口感甜脆、營養豐富，同時具有抗癌防癌保健功能，深受廣大消費者喜愛。我國花椰菜栽培面積和產量均位列世界第一，2019年我國花椰菜（包括青花菜）種植面積達5.467×105 hm2，約占世界總面積40%;產量達1.071×1010 kg，占世界總產量的40.67%[1]，花椰菜在我國蔬菜生產中占有重要地位。

我國花椰菜分子育種研究雖然起步較晚，但是花椰菜全基因組序列圖譜的公布和釋放[2-3]，極大地推動了花椰菜基因功能研究及生物育種技術的發展，對定位花椰菜重要農藝性狀，揭示花球發育機制以及開展高效、精準分子聚合育種有著里程碑式的作用。建立高效、成熟的遺傳轉化體系是所有作物開展生物學研究的基礎，特別是近年來基因編輯技術在許多農作物上的成功應用，實現了大量重要農藝性狀精準改良，構建高效、成熟的植物遺傳轉化技術體系顯得尤為重要。

目前，基于農桿菌介導的CRISPR/Cas9技術體系已經成功應用于水稻、玉米、大豆等農作物[4]。在甘藍類蔬菜作物功能基因的研究過程中，研究者已利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得早花、雄性不育、無葉片蠟質層等具備優良性狀的育種材料[5-7]，此方法可快速地將優異基因變異向育種材料中累積，為高產、優質、多抗新品種的培育提供了新的技術儲備[8]。然而目前該技術在花椰菜上的應用尚未見報道。

本研究參照甘藍型油菜遺傳轉化體系[9]，以花椰菜‘FQ-36為受體材料，以花青素合成途徑中的關鍵功能基因BoANS為靶標基因，構建CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化體系進行靶向編輯，擬構建花椰菜高效CRISPR/Cas9基因編輯技術體系，整合花椰菜基因編輯技術、全基因組生物信息數據庫和種質資源表型數據庫，對搭建4.0版本花椰菜分子設計育種平臺具有極大的推動作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

花椰菜育種材料‘FQ-36，由天津市農業科學院蔬菜研究所提供。該品系秋季栽培成熟期130 d，株型直立上沖緊湊，波浪型葉片，葉色深綠色，花球周正緊實、細嫩、平整，不抗黑腐病和霜霉病，遇低溫、高溫、強光等逆境脅迫花球表面易呈現著色不均的紫色。

1.2 載體

過渡載體（pCBC-DT1T2）和植物表達載體（35S-pKSE401）菌株由華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室戴成老師提供。大腸桿菌為DH5α感受態細胞。根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）為GV3101感受態細胞。

1.3 sgRNA設計與CRISPR/Cas9載體構建

利用CRISPR-PV2.0在線軟件（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）對BoANS基因（Bol014986）序列進行靶位點分析。靶位點選擇標準：（1）位于基因外顯子上;（2）GC含量不低于40%;（3）靠近基因編碼區5端;（4）特異性好、脫靶效應低[10]。

CRISPR載體構建具體方法步驟詳見參考文獻[11]。以pCBC -DT1T2 為模板進行引物 PCR 擴增，得到含兩個靶點（DT1 和 DT2）序列的gRNA表達盒，柱式DNA片段純化試劑盒純化后，用BsaI酶切PCR純化產物和pKSE401并用T4DNA ligase 連接，得到最終載體。載體于-80 ℃下儲存備用。

1.4 農桿菌介導的花椰菜遺傳轉化

農桿菌介導的花椰菜遺傳轉化體系以及使用的培養基配方主要參考甘藍型油菜遺傳轉化方法[9]，具體如下：切取0.8～1 cm左右的下胚軸作為外植體，用含有重組質粒的農桿菌菌液（OD=0.5）侵染外植體30 min，轉入M1培養基上在25 ℃、黑暗條件下共培養2～3 d，再轉入含卡那霉素的愈傷組織誘導M2培養基上，在26/22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下繼續培養21 d，然后將外植體轉入芽分化M3培養基上，在26/22 ℃、16 h 光照/8 h 黑暗條件下繼續培養14 d，最后切取幼芽，轉入M4生根培養基，溫度為26/22 ℃、光照條件為16 h 光照/8 h 黑暗。生根后移入基質，培養室內煉苗，移栽至大田繼續培養，收獲種子。

1.5 CRISPR/Cas9編輯植株的分子檢測與表型鑒定

采用改良的CTAB法提取待檢測植株的基因組DNA。經瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000檢測，DNA濃度調至100 ng·μL-1備用。以其為模板，使用載體特異性引物U626-IDF 、U629-IDR（U626-IDF：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC;U629-IDR：AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC）進行PCR擴增。反應體系為：Premix Taq（KaRaTaqTM Version 2.0）5 μL、DNA模板1 μL（20 ng）、上下游引物各0.2 μL（0.2 μM）、ddH2O 3.6 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性4 min;95 ℃10 s，61 ℃15 s，72 ℃1 min，35個循環;72 ℃延伸7 min。擴增產物由1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并計算轉化效率（轉化效率=轉基因陽性株數/總成株數）。對基因編輯陽性植株的表型進行觀察和記錄。

2 結果與分析

2.1 靶位點設計及載體構建

根據在線軟件CRISPR-PV2.0分析結果，基于靶位點選擇標準，在BoANS基因上選取了2個靶位點，即5'-GTCTTGTTTATCCTGAAGAC-3'，5'-GTCTTCAGGATAAACAAGAC-3'。并在此基礎上設計了用于CRISPR/Cas9載體構建的引物序列（表1）。

使用CRISPR-ANS-BsF、CRISPR-ANS-F0，CRISPR-ANS-R0、CRISPR-ANS-BsR 4對引物對過渡載體pCBC-DT1T2進行擴增，電泳檢測并回收純化。純化后的質粒通過邊酶切邊連接方法連接到pKSE401載體上，成功獲得pKSE401-sgRNA重組質粒。

2.2 農桿菌介導的花椰菜遺傳轉化技術體系的建立

參照甘藍型油菜遺傳轉化技術體系，經過60 d左右的培養，獲得了花椰菜遺傳轉化再生植株（圖1）。

2.3 花椰菜再生植株的載體插入陽性檢測

將生根的幼苗移栽到華中農業大學油菜工程中心轉基因基地，共移栽24株，其中22株成活。對成活的再生植株收集幼嫩葉片提取DNA，利用U26啟動子引物對這些植株進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測發現13株陽性株，對應泳道分別為1、2、3、4、5、6、7、11、12、13、15、16、21，這13株陽性株都擴增出726 bp的特異性條帶（圖2），與陽性對照（重組質粒）的擴增結果一致，由此初步判斷這些為陽性轉化植株，轉化效率為59.09%。

2.4 轉基因花椰菜植株的田間表型鑒定

田間調查發現，13株轉基因陽性植株均能正常結球，與野生型（圖3-A）相比，有3株陽性植株花球紫色明顯減弱，尤其是編號21號陽性株（圖3-B）紫色減退非常明顯，初步說明這些植株BoANS基因發生了突變。遺憾的是，由于武漢新冠疫情的暴發沒有對這些植株的編輯位點進行檢測，也沒能從這些植株上收獲種子。

3 結論與討論

目前基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術已經在多種植物中成功應用，建立高效、成熟的遺傳轉化體系對植物開展關鍵基因功能解析以及精準分子設計育種至關重要。蕓薹屬作物中結球甘藍、芥藍已經建立了成熟的遺傳轉化體系并實現了資源改良創制[12-13]，花椰菜是遺傳轉化體系比較成熟，遺傳轉化效率相對較高的蕓薹屬作物[14-15]，但目前還未見花椰菜基因編輯技術方面的相關報道。

ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）是植物類胡蘿卜素生物合成途徑的關鍵酶，當編碼ZDS的基因沉默后，植物新生葉片將出現明顯白化現象。鄭愛紅等[16]巧妙地把芥藍BoZDS作為目標基因，以再生植株白化表型標記和Sanger測序檢驗編輯體系突變效率，成功構建了芥藍CRISPR/Cas9基因編輯技術體系，轉化效率達68.42%，本研究篩選的試驗受體材料以及選擇的目標基因與鄭愛紅試驗設計有相似之處。本試驗材料為‘FQ-36，前期預試驗表明其再生率顯著高于其它花椰菜品系，是非常理想的遺傳轉化受體材料，此外該材料極易受環境影響，當遇到高溫、低溫、強光照等逆境脅迫花球極易變紫，因此花球是否變紫可作為驗證基因編輯體系的表型標記?；ㄇ嗨睾铣擅福ˋNS，anthocyanin synthase）是植物花青素合成的關鍵酶，催化花青素生物合成的倒數第2步，使無色花色素轉變成有色花色素。ANS基因變異和表達量差異使植物呈現紫色、紅色、粉色、黃色、白色等顏色，并且已經在覆盆子、石榴、草莓等多種植物中證明ANS基因突變是導致植物組織變成白色的重要原因[17-19 ]。前期試驗通過代謝組和轉錄組數據分析，驗證了ANS等是調控低溫花球變紫的關鍵基因[20]，本試驗以BoANS為目標基因對CRISPR/Cas9技術在花椰菜上的應用進行了初步探索，并成功構建了花椰菜基因編輯技術體系，轉化效率達59.09%。

天津市農業科學院與華中農業大學通過項目合作，將甘藍型油菜遺傳轉化體系成功應用于花椰菜中[9]，建立了花椰菜基因編輯遺傳轉化技術體系，并已經成功應用于花椰菜優異資源的創制中。

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