胰島素樣生長因子結合蛋白4在非小細胞肺癌中的表達及作用

趙嘉璐 李偉文 藍偉紅 藍秀 熊雪芳 孫蕾

肺癌是一種預后極差的高度惡性腫瘤疾病，按照WHO肺癌的病理學分類可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，而非小細胞肺癌在臨床中更為常見[1]。近些年來，無論是外科技術的提高或放化療方案的優化，還是針對肺癌驅動基因的分子靶向治療的問世，包括已經進入臨床應用的表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）等，都未能使肺癌患者的5年生存率明顯提高（仍然低于15%）[2]，因此尋找新的治療靶點和療法對提高患者生存率有著重要意義。

胰島素樣生長因子（IGF）在調節細胞生長、分化和惡性轉化方面起著至關重要的作用，其生物活性受胰島素樣生長因子結合蛋白家族（insulin-like growth factor binding protein，IGFBPs）調節。胰島素樣生長因子結合蛋白4（IGFBP-4）為最小的IGFBP，是一個重要的抑制蛋白，與IGF具有高親和力[3]，近些年的大量研究表明，IGFBP-4在多種腫瘤的生長調控中都表現出了極其重要的作用，其主要通過結合組織自分泌的IGF從而抑制腫瘤的生長[4-8]。目前，IGFBP-4在肺癌中的表達及作用尚不清楚。本研究通過檢測非小細胞肺癌組織中IGFBP-4的表達情況，并觀察其對非小細胞肺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響，初步探討其可能的作用機制，為肺癌的治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 非小細胞肺癌A549細胞購自上海中科院細胞庫。A549細胞置于含10%FBS、1%雙抗的RPMI 1640培養基中，在37℃、5% CO2培養箱中培養。人重組 IGFBP-4（美國 R&D 公司，批號：804-GB），BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白質Marker、膜封閉液和ECL發光液（美國Thermo公司）。兔抗人IGFBP-4單抗（美國R&D公司，批號：AF804），鼠抗人Fibronectin單抗（美國Santa公司），鼠抗人c-fos單抗（英國Abcam公司），鼠抗人β-actin單抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（中國聯科生物公司）。CCK-8試劑盒（日本Dojin公司）。

1.2 組織樣本采集 收集麗水市中心醫院2008年1月至2020年1月行手術治療的20例非小細胞肺癌患者的肺癌組織和正常肺組織（腫瘤邊緣5 cm外的肺組織，并經組織病理切片檢查證實），組織樣本均為手術后立即采集，所有患者術前均未進行化療或放療。組織病理類型的判斷標準參照WHO肺癌的病理學分類。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8法。使用96孔平底細胞培養板，各孔接種A549細胞濃度為2 000個。將A549細胞分為Control組和不同濃度IGFBP-4（5、50、500 ng/ml）處理組。4組細胞經無血清培養液饑餓培養24 h后，Control組不做任何處理，其余3組采用不同濃度的IGFBP-4處理細胞，分別在1、2、3和4 d時加入10 μl CCK-8溶液，將培養板置于培養箱內孵育2 h，酶聯免疫檢測儀下選擇波長450 nm測定各孔吸光度，根據各組細胞的吸光度值繪制4 d的細胞生長曲線。選出細胞增殖活性最佳的細胞組進行以下實驗。

1.4 細胞集落形成 采用平板克隆實驗。將A549細胞以500個細胞的密度分別接種含10 ml培養液的培養皿中，用IGFBP-4 500 ng/ml處理，并在RPMI1640中孵育14 d形成細胞集落。采用考馬斯藍染色后對細胞集落進行成像，計算克隆形成的細胞集落數量。實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞遷移能力和侵襲能力的檢測

1.5.1 細胞遷移能力檢測 采用Transwell實驗檢測。消化A549細胞，離心（800 r/min）棄上清液，用含BSA的無血清培養基重懸，調整細胞密度至1×105個/ml。取細胞懸液200 μl加入Transwell小室，24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培養基，置培養箱培養20 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定后0.1%結晶紫染色，用棉簽擦去上層未遷移細胞，隨機觀察6個視野細胞并計數。實驗重復3次，取平均值。

1.5.2 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗檢測。將 Matrigel 1∶3稀釋，取10 μl鋪于 Transwell小室底部膜的上室面成膠。消化A549細胞，離心（800 r/min）棄上清液，用含BSA的無血清培養基重懸，調整細胞密度至1×105個/ml。取細胞懸液 200 μl加入 Transwell小室，24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培養基，置培養箱培養24 h后取出 Transwell小室，4%多聚甲醛固定后0.1%結晶紫染色。用棉簽擦去上層未遷移細胞，隨機觀察 6個視野細胞并計數。實驗重復3次，取平均值。

1.6 IGFBP-4、Fibronectin和c-fos表達水平檢測 采用 Western blot法。收集肺癌組織（T）、正常肺組織（N）標本及A549細胞（Control組和IGFBP-4組），提取蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取40 μg蛋白樣品經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，加二抗室溫孵育，再用TBST緩沖液洗膜，ECL化學發光顯色，凝膠成像系統自動曝光，檢測IGFBP-4、Fibronectin和c-fos蛋白的表達水平。實驗重復4次，取平均值。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IGFBP-4在肺癌組織中的表達 IGFBP-4在肺癌組織中的表達水平為0.50±0.19，正常組織中表達水平為1，IGFBP-4在肺癌組織中的表達水平明顯低于正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 肺癌組織和正常組織IGFBP-4表達的電泳圖

2.2 IGFBP-4對A549細胞增殖的影響 生長曲線顯示，A549細胞經50、500 ng/ml IGFBP-4處理后增殖活性明顯低于 Control組（均 P＜0.05），見圖 2a。與Control組相比，用500 ng/ml IGFBP-4處理的A549細胞中形成的細胞集落數量為（65.33±17.47）個，明顯低于 Control組的（149.66±25.50）個，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖 2b。

圖2 IGFBP-4對A549細胞增殖的影響（a：4組細胞的生長曲線，與Control組比較，*P＜0.05；b：兩組細胞集落數量的比較）

2.3 IGFBP-4對A549細胞遷移和侵襲能力的影響與Control組比較，用500 ng/ml IGFBP-4處理的A549細胞的遷移和侵襲能力明顯降低（均P＜0.05），見圖3（插頁）、表1。

表1 兩組細胞遷移和侵襲能力的比較（個）

圖3 A549細胞遷移和侵襲圖像（a：細胞遷移；b：細胞侵襲；結晶紫染色，×200）

2.4 IGFBP-4對A549細胞Fibronectin和c-fos蛋白表達水平的影響 在500 ng/ml IGFBP-4處理48 h后，與Control組相比，IGFBP-4下調Fibronectin和c-fos蛋白的表達水平（均 P＜0.05），見圖 4、表 2。

圖4 兩組細胞Fibronectin和c-fos蛋白表達的電泳圖

表2 兩組細胞Fibronectin和c-fos蛋白表達水平的比較

3 討論

IGFBPs由6種不同的蛋白成員（IGFBP1-6）組成，對IGF-1和IGF-2有很高的抑制作用[9]。IGFBP-4作為最小的成員，已被證實是一個重要的抑制蛋白，與IGF具有高親和力[3]，存在于所有的生物體液中，由不同類型的細胞合成以自分泌或旁分泌的形式發揮作用，其生理功能主要由參與調解IGF的經典途徑和不依賴于IGF的非經典途徑構成[10]。IGFBP-4主要是與胰島素樣生長因子受體（IGFR）競爭結合IGF而調節IGF的生物學作用，從而在各種生理和病理過程中發揮重要作用，大量研究的顯示，其主要通過結合IGF從而發揮抗腫瘤作用[4-8]。

作為IGFBPs的一個重要成員，IGFBP-4已成為許多惡性腫瘤研究的熱點[3，11-12]。研究表明，IGFBP-4可以抑制結直腸癌、乳腺癌和膠質母細胞瘤細胞的生長[13-15]。雖然IGFBP-4作為抑癌基因被逐漸認識，但其在肺癌組織中的表達及作用機制尚不明確。本研究采用Western blot法檢測20例肺癌組織及鄰近正常組織中IGFBP-4蛋白的表達情況，結果顯示IGFBP-4在肺癌組織中的表達明顯下調，且前期研究表明IGFBP-4能促使肺癌細胞凋亡[16]，結果提示在肺癌的發生、發展過程中IFGBP-4可能扮演著重要角色。同時，筆者觀察IGFBP-4對A549細胞增殖、遷移和侵襲的影響，結果發現，經IGFBP-4處理的A549細胞的增殖活性、遷移和侵襲能力明顯低于Control組，說明IGFBP-4在肺癌中可能作為抑癌基因抑制肺癌細胞的生長。

Fibronectin即纖粘連蛋白，是一種與腫瘤的復發、轉移密切相關的重要的細胞蛋白。Fibronectin的表達隨著腫瘤惡性程度的增高而增強，與腫瘤的分級及預后有關[17-18]。眾所周知，c-fos原癌基因被描述為一種即時的早期反應基因，其中c-fos的高表達可誘導腫瘤的形成，反映細胞的增殖活性，與腫瘤細胞的浸潤、轉移及預后相關[19]。進一步研究發現，IGFBP-4顯著降低Fibronectin和c-fos蛋白的表達，這些結果表明IGFBP-4可能是肺癌發生、發展中潛在的負調節因子，通過下調Fibronectin和c-fos表達在肺癌的增殖中起著關鍵作用。

總之，本實驗通過檢測IGFBP-4在肺癌組織中的表達，發現IGFBP-4在肺癌組織中的表達明顯降低，發現IGFBP-4抑制腫瘤細胞增殖的分子機制可能主要通過下調Fibronectin和c-fos的表達，說明IGFBP-4在非小細胞肺癌細胞中具有較強的抗腫瘤作用，并可能為未來肺癌的治療提供新的思路。