瓜表皮有刺毛和無刺毛佛手瓜轉錄因子SeTTG1的分離及表達分析

譚國飛,吳小玉,羅 慶,王孝敬,李裕榮,鐘秀來,孟平紅*

(1貴州省農業科學院園藝研究所,貴陽 550006;2安順學院農學院,安順 561000;3貴州大學茶學院,貴陽 550025)

佛手瓜(Sechium edule)別名捧瓜、安南瓜、豐收瓜、壽瓜、洋瓜等,是一種多年生具蔓性的葫蘆科佛手瓜屬草本植物。佛手瓜原產于中美洲、墨西哥及印度群島,19世紀初傳入中國[1]。佛手瓜在中國多地均有種植,在山東省,佛手瓜產量在67 500 kg/hm2以上,產品銷往全國各大城市[2]。伴隨山區佛手瓜栽培技術的提高,佛手瓜逐漸在貴州省部分地區大規模種植,種植面積達1.07萬hm2,主要分布在貴州省惠水縣、紫云縣和織金縣[3]。

佛手瓜營養豐富,富含鋅、鐵、鈣、鎂、維生素E、維生素C等多種有益于人體的維生素和礦物質[1]。另外,佛手瓜性涼味甘,歸肺、胃、脾經,具有祛風解熱,健脾開胃的功效,對風熱犯肺、頭痛、咽干、咳嗽、胃濕熱諸癥有一定的功效,適宜于消化不良、胸悶氣脹、嘔吐、肝胃氣痛以及氣管炎咳嗽多痰者食用[4]。佛手瓜清脆無怪味可作水果生吃,炒菜涼拌亦可煮湯、作餡等;其嫩梢、卷須、嫩葉可作為葉用菜食用,其地下塊根肥大,也可食用。此外佛手瓜瓜形獨特,分枝性強,具有蔓性,適于在庭院內作為觀賞性棚架種植[5]。

佛手瓜瓜表皮有肉刺(皮刺)能夠保護瓜不被外來生物侵害。但表皮有刺的佛手瓜不便于采摘、食用,尤其在運輸途中瓜與瓜之間容易相互摩擦,不利于儲存和銷售,逐漸被表皮光滑無刺的佛手瓜種淘汰。研究表明,表皮毛的起始和發生由多個轉錄因子相互作用完成,特定轉錄因子,如GL2(GLABRA2)、GL3(GLABRA3)和TTG1(TRANSPARENT TESTA GLABRA 1)是細胞產生表皮毛的主要調節物[6-7]。其中,轉錄因子TTG1是影響植物莖、葉片、種子、果實等表皮毛發育的重要調控因子之一[7-8]。在絕大多數植物組織中,TTG1缺失的突變體無表皮毛,但當TTG1在植株中過表達時會使得原本沒有根毛的表皮細胞上產生多余的根毛。劉凱歌等[9]研究表明,TTG1-1廣泛存在于油菜營養組織和發育的種子中,在ttg1-13突變體背景下,異源表達TTG1-1能夠恢復該突變體的多個表型。甘藍型油菜TTG1-1與擬南芥TTG1在植物生長發育的多個生物學過程中具有類似的功能[9-10]。譚國飛等[8]研究表明,轉錄因子TTG1與胡蘿卜種子刺毛的發育相關。在佛手瓜中,TTG1因子與瓜表皮的研究未見報道。本研究通過對分離的SeTTG1進行生物學分析,以期初步確定其與佛手瓜表皮刺毛發育的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植

有刺佛手瓜來源于貴州省荔波縣洞長村,無刺光滑的佛手瓜來源于貴州省都勻市茶農村。將2種佛手瓜材料種植于貴州省農業科學院園藝研究所,于2020年9月20日分別采集表皮有和無刺毛的佛手瓜根、莖、葉、瓜,快速切成小片段,裝入50 mL冷凍管中,液氮速凍后-80℃超低溫冰箱中保存。重復3次。

1.2 佛手瓜RNA提取與cDNA合成

使用RNA Simple Total RNA Kit(Tiangen,北京)試劑盒提取各材料的總RNA。用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測總RNA完整性,用微量分光光度計Nanodrop 1000(Nanodrop Technologies Inc.,DE,USA)測定樣品的總RNA濃度。使用PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)(TaKaRa,日本)進行反轉錄。將產物保存于-20℃冰箱。

1.3 佛手瓜SeTTG1的克隆

以瓜皮有和無刺毛佛手瓜反轉錄成的cDNA為模板,根據貴州省農業科學院園藝研究所建立佛手瓜轉錄組數據庫(未公布),以佛手瓜SeTTG1(序列編號:TRINITY_DN36982_c0_g1)為參考序列,設計引物(SeTTG1-F和SeTTG1-R,表1)克隆目的轉錄因子SeTTG1。反應體系為:15μLExTaq、1μL cDNA、正反引物各1.0μL、12μL滅菌的ddH2O。反應程序為:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸3 min,34個循環;72℃延伸10 min;4℃保存。

表1 引物序列Table 1 Primers sequences

利用1.2%的瓊脂糖凝膠分離目的條帶,并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-180801,Tiangen)回收目的產物,將其連接到pMD18-T克隆載體上,熱激法(42℃,60 s)轉化到大腸桿菌DH5a上。利用含AMP(氨芐青霉素,100 mg/L)的平板篩選,倒置于37℃黑暗培養箱培養14 h后,挑取單菌落搖菌,進行PCR鑒定。鑒定正確的菌液送到南京金斯瑞生物科技有限公司測序。

1.4 佛手瓜SeTTG1的進化及其保守結構域分析

根據佛手瓜SeTTG1轉錄因子可翻譯的閱讀框,推導對應的氨基酸序列并翻譯得到對應蛋白序列。下載NCBI蛋白數據庫中刊載的30個其他物種(26個植物,3種真菌和1種原生生物,其中小麥TTG1為不完全序列)的TTG1序列(表2),用MEGA5.2軟件鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構建系統進化樹。Bootstrap檢驗值設為1 000[11]。利用SMART在線數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析各物種保守基序。

表2 各物種TTG1蛋白Table 2 TTG1 proteins from different species

1.5 佛手瓜不同部位SeTTG1的表達分析

設計引物(SeTTG1-qF和SeTTG1-qR,表1),利用實時熒光定量PCR檢測2種佛手瓜不同部位SeTTG1轉錄因子的表達水平,所用儀器為CFX Connect PCR儀(Bio-Rad,Hercules,CA)。熒光PCR試劑盒為AceQ qRCR SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。檢測體系:10μL熒光酶,正反引物各0.5μL,7μL滅菌的ddH2O,2μL的cDNA。反應程序為:95℃30 min;95℃5 s,55℃10 s,40個循環;72℃2 min;8℃保存。以佛手瓜ACTIN為內參基因(引物為:ACTIN-qF和ACTIN-qR,表1)。

1.6 數據分析

SeTTG1表達數據分析參照基因相對定量ΔCT法,表達差異量為2-ΔCT,ΔCT=CT-Cactin。相對定量是基于處理和對照之間,目標基因對參考基因的表達量的比較[12]。用Microsoft Excel 2007軟件作數據統計分析,用IBM Statistics 20.0軟件作顯著性分析,顯著水平設置為P＜0.05和P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 佛手瓜SeTTG1轉錄因子的分離

2種類型佛手瓜表皮形態上存在明顯的差異(圖1)。以2種類型佛手瓜獲得的cDNA為模板,均克隆得到了1條ORF長度為1 026 bp的SeTTG1轉錄因子,但在421、466、594、683和780位點存在差異(圖2)。

圖1 表皮無刺(左)與表皮有刺(右)佛手瓜Fig.1 S.edule fruit with peel hairless(left)and peel hairy(right)geotypes

圖2 表皮有和無刺毛佛手瓜SeTTG1轉錄因子序列比對Fig.2 Sequence alignment of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

2.2 佛手瓜SeTTG1氨基酸分析

對2種類型佛手瓜克隆得到的SeTTG1轉錄因子對應的蛋白序列分析,結果顯示有3處存在差異,分別為141、156和228處(圖3)。前人對植物TTG1氨基酸保守區域預測表明,植物中TTG1存在4個保守的WD40區域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)[8,13]。SMART在線分析表明瓜皮有刺和無刺毛佛手瓜SeTTG1均含有4個WD40區域(圖3)。

圖3 表皮毛有和無佛手瓜SeTTG1蛋白序列比對Fig.3 Alignment of amino acid sequences of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

2.3 佛手瓜SeTTG1進化分析

佛手瓜為葫蘆科植物,由圖4可知,SeTTG1蛋白與葫蘆科植物南瓜、黃瓜、西葫蘆和苦瓜TTG1蛋白同源性較高;禾本科、豆科、蓮科、薔薇科植物關系較近;真菌中的3種生物與植物關系較遠,單細胞原核生物位于進化樹底端,與植物、真菌關系較遠。

圖4 不同物種TTG1蛋白進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of TTG1 proteins from different species

TTG1蛋白結構域分析表明,小麥(不完整序列)和胎三毛滴蟲只有Ⅰ和ⅡWD40基序結構。根內球囊霉、新型隱球酵母和嗜山梨條藻等3個真菌中無WD40基序,表明植物與真菌及單細胞動物之間TTG1進化差異大。25種植物的第Ⅰ個WD40基序存在差異,豆科第Ⅱ個基序上為40個堿基,其余為46個,第Ⅲ和第Ⅳ個基序長度一致(表3)。說明TTG1在物種之間相對保守,在植物、真菌和單細胞生物中存在特異性。

表3 不同物種TTG1蛋白序列WD40基序及長度預測Table 3 Prediction of WD40 motifs and length of TTG1 proteins from different species

(續表3)

2.4 佛手瓜轉錄因子SeTTG1在不同部位表達分析

熒光定量PCR結果顯示,2種佛手瓜根和葉中,SeTTG1表達水平無顯著差異;在莖中SeTTG1在有刺毛佛手瓜中表達水平顯著(P＜0.05)高于無刺毛佛手瓜,為1.36倍;而在瓜中SeTTG1表達量在有刺毛中表達量極顯著(P＜0.01)高于無刺毛佛手瓜,為35.64倍(圖5)。

圖5 瓜表皮有刺毛和無刺毛佛手瓜不同組織SeTTG1表達分析Fig.5 Different tissue expression analysis of SeTTG1 in S.edule fruit with peel hairless and peel hairy

3 討論

表皮毛對植物抵抗不利的外界環境,如高溫、低溫、輻射、干旱、病蟲害具有重要作用[7,14-16]。同時,植物表皮毛能夠為人類提供特殊的產品,如棉纖維是人類重要的纖維來源[17];茶葉中葉片表皮毛(茶毫)能夠分泌多酚、多糖物質,增加茶葉風味[18-19]。同時,植物表皮毛的存在也影響人類的健康生活,如懸鈴木葉片表皮毛和種子毛、楊樹及楊柳的柳絮等,已成為很多城市的主要污染物之一,可引起人類的呼吸道感染、肺部感染、發熱和流感等[20]。而一些園藝產品,如白菜、芥菜、茄子、菠菜、胡蘿卜、西紅柿、花椒等,葉片、種子中刺毛的存在影響播種、采收及食用。為此,無刺毛品種的培育具有一定的現實意義[8,21-22]。

對貴州省主要種植區域進行調研發現,絕大部分種植的佛手瓜表皮光滑無刺。本研究中,有刺佛手瓜商品性狀差,采摘易傷手,采摘后瓜與瓜之間易碰傷,且有刺的佛手瓜瓜表皮易木質化和纖維化,影響食用品質。植物TTG1作為調節表皮毛發育的主要轉錄因子之一,對植物葉、莖、種子、瓜等表皮刺毛的發育具有重要作用[7,23-25]。本研究中,在有刺毛和無刺毛瓜中,SeTTG1核苷酸序列有5個位點不同,推導氨基酸存在3處差異,有刺毛的瓜SeTTG1表達量極顯著高于無刺毛的瓜。觀察發現,在2種類型佛手瓜的葉、莖表皮中均含有表皮毛,但有刺毛的佛手瓜莖中表達量顯著高于無刺毛佛手瓜,葉片中無差別。根毛作為植物表皮刺毛中的一部分,在2種類型瓜中均有表達,但無顯著差異,本研究結果與胡蘿卜種子DcTTG1表達分析結果相似[8]。說明佛手瓜中SeTTG1因子影響瓜皮刺毛的發生。

植物表皮毛的發育受到各種因素影響[7,14-16],在貴州栽培表皮無刺的佛手瓜過程中,特殊的天氣下,如高溫、低溫、干旱等天氣,瓜表皮刺毛易產生。將表皮無刺的佛手瓜品種種植在高海拔或者低海拔高溫地區,其瓜皮上可能也會產生刺毛。佛手瓜在成熟過程中,特別是瓜表皮在老化過程中,往往也會形成一些明顯的瓜表皮刺毛。為此,篩選性狀穩定的無刺毛佛手瓜品種,將是新品種培育的方向之一。