汞離子熒光生物傳感器的構筑及性能表征*

韋柳丹，鄭亞楠，王 丹

(南寧師范大學 化學與材料學院，廣西 南寧 530001)

0 引言

汞已被廣泛應用于汽車制造、煉油、電力、能源電池等多個行業[1-4]。工業大生產導致大量汞隨工業廢水排放到自然環境中，排放的汞污染隨著生物鏈極易進入人體，并在人體內不斷累積，導致嚴重的腦損傷和腎臟疾病[5-8]。為了有效防御汞污染的暴露對人類的危害，開發經濟、實用、實時的汞污染現場檢測技術極為重要。目前，檢測汞離子的常用技術手段有原子吸收光譜法(AAS)、原子熒光光譜法(AFS)、電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES)等[9-12]。這些方法具有良好的靈敏度和選擇性，但是在使用這些檢測方法時也存在很多局限性。比如，儀器維護成本高、預處理復雜、工作環境要求高、依賴專業的操作人員等缺點，極大地限制了它們作為野外便攜式設備用于自然環境中汞污染的簡單和快速分析。

熒光光譜分析法是檢測重金屬的有力工具。迄今為止，已經開發了大量的熒光探針用于檢測金屬離子，包括納米粒子、生物分子、化學小分子和高分子聚合物等[13-16]。其中，熒光蛋白可利用其固有的或者構建的金屬離子結合特性，有效地檢測金屬離子[17-22]。此外，由于可遺傳編碼的特性，熒光蛋白在追蹤活細胞內的金屬動力學方面具有獨特的優勢[23]。然而，由于制備和保存的困難，它們在實踐中幾乎沒有應用于金屬污染的檢測。因此，值得嘗試去克服這些限制，將熒光蛋白應用于工業廢水中重金屬離子的現場可視化檢測。

本項研究成功設計了能夠響應Hg2+信號的熒光蛋白突變體 (mCherry L199C)。如圖1，變體蛋白mCherry L199C是通過在熒光蛋白發射團附近引入一個半胱氨酸，Hg2+與半胱氨酸殘基的結合會改變發色團周圍環境的對稱性，進而促使熒光發生猝滅。經性能測試分析發現，隨著Hg2+濃度的增加該熒光生物傳感器的熒光強度不斷降低，而在加入Hg2+的螯合劑EDTA以后，其熒光強度又可以很大程度的恢復。其次，該熒光生物傳感器對目標金屬離子Hg2+的響應程度遠高于其它金屬離子，并且在干擾離子存在的情況下其對Hg2+的響應程度基本不受影響?；谠摕晒馍飩鞲衅髁己玫捻憫阅?，利用蛋白質固定化技術開發了一種蛋白-瓊脂糖凝膠試紙，實現了水環境中汞污染的簡單、便捷和快速的可視化檢測。

圖1 熒光蛋白mCherry發色團的周圍環境及突變體L199C的響應機理

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

本試驗所用的酶購自寶日醫生物技術(北京)有限公司，所涉及到的引物合成及測序均由上海生工生物工程有限公司完成，所有化學試劑均購自上海阿拉丁生化科技有限公司，配制緩沖液的試劑除特殊說明均為國產分析純試劑。所使用儀器主要包括熒光分光光度計(日本島津，RF-6000)、紫外分光光度計(日本島津，UV-3600PLUS)、圓二色光譜儀(英國應用光物理，Chirascan)和紫外暗室分析儀(上海寶山谷村電光儀器廠，ZF-20D)。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光生物傳感器表達載體的構建

通過分子克隆和定點突變技術把mCherry及突變體mCherryL199C的基因片段克隆至質粒pET28α中，獲得mCherry及突變體mCherryL199C的表達載體。具體流程如下：首先利用PCR技術從模板質粒上大量擴增mCherry基因片段；接著，利用限制性內切酶NdeI和XhoI對載體質粒pET28α和目的基因mCherry片段分別進行雙酶切，從而使它們各自帶有相同的粘性末端；最后，使用T4 DNA連接酶將載體質粒pET28α和目的基因片段mCherry連接，實現mCherry-pET28α表達載體的構建。構建的載體經PCR初步鑒定成功后送至上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定，以確?；蛐蛄型耆_。以mCherry-pET28α重組質粒為模板，使用 PCR定點突變技術，獲得突變體mCherryL199C-pET28α的表達載體。將這些表達載體通過化學法分別轉化至大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株中，用于后續的誘導表達實驗。

1.2.2 熒光生物傳感器的體內表征實驗

將構建好的表達菌株mCherry-pET28α(對照組)和mCherryL199C-pET28α(實驗組)分別接種至含30 μg/mL卡那霉素的LB培養基中，在溫度為37℃轉速為250 r/min的條件下過夜培養。過夜培養的菌液和培養基按1∶100的比例進行擴大培養，直至菌液的濁度值OD600=0.5～0.6時，加入終濃度0.5 mM的IPTG在16°C進行誘導表達12 h。將表達目的蛋白的菌液濁度值調至OD600=1后，按8 mL/管進行分裝并通過高速離心的方式進行收集。菌餅用10 mM的PBS緩沖液洗滌兩次后，使用1 mL的10 mM的PBS緩沖液重懸。向重懸的菌液中加入不同濃度的Hg2+后，在室溫避光條件下在搖床上孵育1.5 h，之后使用熒光分光光度計測定熒光值。本實驗對照組和實驗組各平行做四組，結果取四組數據的平均值。

1.2.3 熒光生物傳感器的表達及純化

將構建好的表達載體mCherryL199C-pET28α按1.2.2步驟中所述的方式進行誘導表達12 h后，通過高速離心的方式進行收集。菌餅使用10 mM的PBS緩沖液重懸洗滌兩次，再經10 mL 超聲裂解液(10 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，25 mM咪唑，5% 甘油)重懸后超聲30 min(超3 s，停5 s，功率為25%)。超聲破碎的細胞離心后獲得上清溶液，并使用0.22 μm的濾膜進行過濾。把含有目的蛋白的上清溶液置Ni-NTA金屬螯合層析柱上，利用親和層析法對目的蛋白進行純化。目的蛋白最終在不斷提高咪唑濃度(75～200 mM)的緩沖液中進行線性洗脫，最終獲得含有His-標簽的目的蛋白mCherry L199C。目的蛋白經蛋白酶HRV3C過夜低溫酶切后去除標簽，最終獲得不帶標簽的mCherry L199C，用于后續的性能表征實驗。

1.2.4 汞離子熒光生物傳感器的性能測試實驗

為了測定熒光蛋白生物傳感器對Hg2+響應的靈敏度，將不同濃度的Hg2+(0～10 μM)加入到純化后的蛋白溶液中，室溫避光條件下放置搖床上孵育0.5 h后，用熒光分光光度計測定蛋白樣品的熒光強度。近一步，向加入Hg2+以后熒光強度發生變化的蛋白質樣品中，再添加不同濃度的金屬螯合劑EDTA孵育0.5 h后測熒光，觀察熒光是否能夠恢復。

為了測定熒光蛋白生物傳感器對Hg2+響應的特異性，分別將8種金屬離子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)添加到純化后的蛋白溶液中，用上述同樣的方式處理后測定樣品熒光值。為了測定熒光蛋白生物傳感器識別Hg2 +的抗干擾性能。將1 μM Hg2+和5 μM其他金屬離子(Cr3+，Cd2+，Pb2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)的混合物分別添加到蛋白溶液中，用上述同樣的方式處理后測定樣品熒光值。

為了研究Hg2+對傳感器二級結構及發色團環境的影響，將不同濃度的Hg2+(0～3.33 μM)添加到蛋白溶液中，室溫黑暗條件下放置搖床孵育0.5 h，分別使用紫外可見分光光度計和圓二色光譜儀(CD)測定其吸收光譜。

1.2.5 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙的制備及對Hg2+的檢測

為了實現對Hg2+的簡單、便捷和快速的可視化檢測，我們利用熱可逆的凝膠瓊脂糖凝膠封裝熒光蛋白制備了蛋白-瓊脂糖凝膠試紙，并使用智能手機的內置攝像頭與紫外暗箱燈開發了在線檢測Hg2+濃度的便攜式設備。具體制備過程為：將加熱熔化的瓊脂糖溶液(0.75%)逐漸冷卻至37℃，然后與熒光蛋白溶液按體積比為5∶3的比例均勻混合。取450 μL混合液放在模具中冷卻定型，并將定型后的凝膠固定在試紙條上。滴加30 μL不同濃度Hg2+溶液在凝膠中心。然后將放置凝膠試紙條放入紫外暗室分析儀，在室溫下孵育5 min后，利用1600萬像素的智能手機在365 nm紫外光照射下拍攝。最后，使用ImageJ軟件對捕獲圖片中每個凝膠小球的亮度進行量化，計算出強度值用作數據分析。

2 實驗結果與討論

2.1 熒光生物傳感器的體內表征實驗

體內實驗研究結果表明(圖2)，在0～100 μM Hg2+濃度范圍內，mCherry的熒光值幾乎沒有任何變化。但是，所設計的熒光生物傳感器mCherry L199C在濃度為10 μM Hg2+的存在下，熒光發生明顯的下降。繼續增加Hg2+濃度至100 μM后，所設計的傳感器mCherry L199C熒光幾乎完全淬滅。由此可知，通過分子設計改構的熒光蛋白突變體mCherry L199C可響應Hg2+的信號。

圖2 對照組mCherry和實驗組mCherry L199C對Hg2+響應

2.2 熒光生物傳感器響應靈敏度及可逆性響應能力

為了便于分析，將測定的熒光值運用ΔF/ΔFmax值擬合，繪制熒光猝滅曲線(圖3)。如圖所示，在0～10 μM Hg2+濃度范圍內，隨著Hg2+濃度的增加，體系熒光值不斷下降，在Hg2+濃度達到10 μM的溶液中，約99%的熒光被猝滅且淬滅非常迅速，在約0.5 min內能夠達到平穩。并且傳感器的熒光在完全猝滅情況下，隨著金屬螯合劑EDTA濃度的不斷增加，其熒光也得到逐漸的恢復，能恢復到其原始熒光的80%。綜上表明，本設計的熒光生物傳感器可快速的響應Hg2+的信號，并且Hg2+與該傳感器的結合具有可逆性，在一定濃度的強絡合物條件下其熒光可很大程度的恢復。

圖3 熒光生物傳感器的猝滅曲線及熒光恢復柱狀圖

2.3 熒光生物傳感器的選擇性及抗干擾能力

從實驗結果可以看出(圖4)，濃度為5 μM的金屬離子(Cr3+，Ni2+，Pb2+，Cd2+，Cu2+，Zn2+，Ag+和Fe3+)對傳感器的熒光幾乎沒有影響。而向上述溶液添加濃度為5 μM Hg2+后，傳感器的熒光猝滅程度達到98%，猝滅程度與單獨加入Hg2+的溶液相比并沒有太大的差異。結果表明，在Hg2+與其他金屬混合的條件下，蛋白對汞離子的識別不會受到其他金屬離子影響,證實了該傳感器對目標金屬離子Hg2+具有良好的選擇性，并且在有其它金屬離子存在時，其對Hg2+的特異性響應不受影響，具有較強的抗干擾能力。

圖4 熒光生物傳感器對單一金屬和混合金屬的選擇性測定

2.4 熒光生物傳感器的響應機理研究

圖5 熒光生物傳感器的圓二色光譜和紫外光譜表征

紫外-可見光譜分析表明，加入Hg2+，熒光生物傳感器mCherry L199C去質子化發色團在波長584 nm處的出現峰值吸收下降。當在1 μM傳感器溶液中添加終濃度3.33 μM Hg2+后，在584 nm處的吸光度降低了5倍。同時，在質子化發色團在450 nm處的吸光度隨著Hg2+濃度的提高不斷上升，并且在500 nm波長處達到等值吸收。與紫外吸收光譜對應，該傳感器圓二色光譜的近紫外范圍內也出現兩個相應的負峰。以上實驗現象表明，Hg2+與傳感器發色團周圍199位引入的半胱氨酸殘基配位后，將改變發色團環境的對稱性,破壞發色團激發過程中的質子轉移過程，從而使質子化的發色團比例下降，進而促使熒光發生猝滅。

2.5 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙對Hg2+的檢測

通過對蛋白-瓊脂糖凝膠試紙的分析(圖6)，可以發現試紙的熒光強度隨著Hg2+濃度的增加而降低。當Hg2+濃度達到10 μM時，蛋白的熒光立即被淬滅。用Image J分析可知，熒光強度隨著Hg2+的增加在0～10 μM的濃度范圍內線性減小，數據顯示出良好的線性相關性(R2= 0.996)(數據點代表至少3個獨立平行實驗的平均值)。當滴加濃度為10 μM其他金屬離子時，試紙的熒光強度與滴加Hg2+的形成較大反差，未發生明顯變化。由此證明了蛋白-瓊脂糖凝膠試紙可以作為高通量篩選工具用于初步檢測自然界中汞污染的存在，通過這種策略可以實現對Hg2+的現場快速可視化檢測。

圖6 蛋白-瓊脂糖凝膠試紙檢測性能測試結果圖

3 結論

本研究成功利用蛋白質工程技術，在粉紅色熒光蛋白mCherry的發色團附近引入易于Hg2+配位的半胱氨酸殘基，通過Hg2+與半胱氨酸殘基結合后對發色團環境的改變，設計出熒光猝滅型的生物傳感器。該傳感器可以快速可逆的響應微摩爾濃度的Hg2+信號，并且對Hg2+的響應具有良好特異性和抗干擾能力。此外，利用蛋白質固定化技術制備的凝膠試紙，不但操作過程簡單、成本廉價、所需時間較短，還可以實現汞污染的現場可視化檢測，有應用價值。