次氯酸熒光探針的研究進展*

李澤強，盛家榮

(南寧師范大學 化學與材料學院，廣西 南寧 530100)

0 引言

活性氧物質(Reactive Oxygen Species，ROS)是指機體內或者自然環境中由氧組成,含氧并且性質活潑的物質的總稱?；钚匝跷镔|包含次氯酸、過氧化氫、超氧化物自由基陰離子、羥基自由基[1-2]?；钚匝跻蜓趸瘜е聶C體的生理發生變化，進而產生多種疾病，如神經退行性疾病或癌癥等[3]。在生理條件下，細胞內的ROS水平經過精細調節，在正常細胞信號轉導、細胞周期、基因表達和體內平衡過程中充當信使。當ROS過量時，會引發許多有害事件：ROS誘導細胞中的氧化應激，隨后導致細胞內的生物大分子(如核酸，膜脂和細胞蛋白)被破壞，這些生物分子的氧化損傷會觸發細胞凋亡，與衰老，多種疾病，癌癥和神經退行性疾病以及糖尿病和炎癥的發病機理密切相關。在近年的檢測中，熒光探針作為一種新型的檢測方法受到了眾多學者的關注。在熒光檢測中，通過把化學信號轉化為光信號，進而實現了對生物體內活性氧穩態檢測。

1 HClO

HClO是一種特殊的活性氧，在抵抗病原體入侵和維持細胞氧化還原平衡等生理過程中發揮著重要作用。HClO是一種強氧化劑,能殺死水里的病菌，一般可作為漂白劑或消毒劑用于家庭清潔、飲用水和游泳池中[5]。一般來說，HClO由過氧化氫和氯離子在過氧化酶的催化下反應生成，HClO的酸度系數為7.46，在pH=7.4生理條件下，HClO處在平衡的狀態。在人體內，HClO通過中性粒細胞中的髓過氧化物酶過氧化氫和氯離子的系統產生。一旦病原體和細菌侵入人體內，HClO作為人體內免疫防御系統中的一部分就能夠對其發動攻擊，在生理和病理過程中起著非常重要的作用[6]。另外，HClO還能夠與生物中的DNA、脂肪酸、蛋白質、膽固醇等多個生物分子發生反應[7]。盡管HClO能夠保護機體健康，但是一旦生物體內的HClO含量過高或分布異常，就會產生氧化應激反應，從而產生一系列的疾病，比如說腎臟疾病、神經退行性病變等等[8]。

2 熒光探針

活性物質對生物體內的物質正常運轉與循環致關重要。在活性物質濃度平衡且正常的狀態下，能夠對生物體內的運轉產生積極的影響，但活性物質的含量出現異常，將會導致生物體內的平衡受到破壞，發生生理紊亂，進而產生一系列的生理疾病。

熒光探針主要是指某些化合物可以與待檢測物發生反應，進而使熒光發生變化來確定待測物質。熒光探針法在生物學和臨床醫學的應用已較為成熟，是生物體內活性物質檢測的重要手段。在熒光探針能將化學信號轉化為光信號。熒光探針法比臨床醫學上的生物體內活性物質檢測的液相色譜法、質譜法[9]有更高的檢出率，并且選擇性和生物相容性更好[10]。因此,近些年來，采用熒光探針法檢測活性物質成為生物體檢測的主要手段，也是該領域的研究主方向。

2.1 熒光探針的識別

熒光探針的設計所采用的機理主要包含分子內電荷轉移(ICT)、光誘導電子轉移(PET)以及熒光共振能量轉移(FRET)。

分子內電荷轉移是熒光探針經常運用的機理[11]?；诜肿觾入姾赊D移機制的熒光探針分子分為D-Π-A結構，其中D表示推電子基團，富含電子；A是拉電子基團，具有吸電子的能力[12]。通過兩者的結合作為識別基團再通過Π鍵的連接得到D-Π-A結構(圖1)，分子內的供給能力不同的基團即可形成電子推拉效應[13]。

圖1 ICT機理熒光探針結構式

2022年，Yang課題組[14]設計并合成了一種新型熒光探針(CA-SO2)，通過親核加成反應可高效、特異地檢測SO2的衍生物，如圖1所示。其設計合成的新型熒光探針 (CA-SO2) 具有高選擇性、快速響應時間(50秒內)和低檢測限(LOD = 75 nM)。由于該探針中存在苯并噻唑的衍生基團，且C=N之間可形成帶有正電荷的銨鹽，進而增強了分子內的ICT效應，使得熒光增強，發出橙色的熒光， 而在探針溶液中加入SO2衍生物后，通過發生親核加成反應，引入了HSO3-從而導致ICT效應減弱，幾乎無熒光，溶液的顏色也尤橙色變為無色，從而達到“肉眼”檢測 SO2的目的。

2.1.2 光誘導電子轉移

光誘導電子轉移(PET)是指電子的給體或電子的受體受到光激發后，激發態的電子的給體與電子受體之間發生電子的轉移進而導致熒光發生淬滅的過程?；诠庹T導電子轉移機制的熒光探針是由識別基因和熒光團通過連接臂連接組成[15]?；诠庹T導電子轉移機制的熒光探針在實際應用的過程中，通過識別基因與熒光團發生電子轉移效應后，探針分子熒光淬滅，在與反應物接觸后，光誘導電子轉移效應受到了抑制，熒光也由此恢復。

2021年，Zhou課題組[16]開發了一種基于萘酰亞胺可用于靈敏和選擇性地檢測生物硫醇的熒光探針(圖2)。該探針設計選擇引入3,5-二硝基吡啶-2-基作為生物硫醇識別位點，由于3,5-二硝基吡啶-2-基具有很強的吸電子能力，從而使該探針發生光誘導電子轉移(PET)進而使熒光猝滅，再通過引入生物硫醇從而觸發親核取代，將3,5-二硝基吡啶基團切斷，從而抑制了PET的過程，進而使得熒光增強，發出黃色的熒光，以達到對生物硫醇的檢測與識別。

圖2 基于PET機理的熒光探針示結構式

2.1.3 熒光共振能量轉移

基于熒光共振能量轉移機制設計的熒光探針一般是將熒光的供體與受體通過化學鍵進行連接的。即在一定的條件下，供體吸收光子后，再通過長距離的偶極-偶極相互作用后，再將能量傳給供體[17]。即在供體向受體進行轉移的過程中，因受到外界光源的刺激后，以非輻射形式實現了能量的轉移(圖2)。此現象即為熒光共振能量轉移(FRET)。

大學生在大學期間學習鋼琴時應注重自身對于所學知識的掌握，只有自身掌握到了知識，才能夠將這些知識通過自己的轉化與研究運用到鋼琴教學中。首先大學生應在大學期間努力積累鋼琴知識，并能夠保證這些知識能夠得以實踐，現在越來越多的大學生都只是自己學會了但并不能夠將這些知識運用到實踐中，也就不能夠很好的運用到鋼琴教學中。因此我認為，當代大學生應首先注重將自身學到的鋼琴知識完全掌握，并能夠保證將所掌握知識熟練到可以運用到實踐當中，再從實踐中吸取經驗并做積累，這樣才能夠在鋼琴教學中將自己所學知識巧妙地運用到鋼琴教學中。

2021年，Tang課題組[18]設計并合成了一種基于BODIPY熒光團的具有FRET機制的新型同型二聚體熒光探針D-TMSPB(圖3)。該探針采用兩個相同的具有小Stokes位移的熒光團連接而形成一個同型2聚體，并且在兩個相同的熒光團之間存在FRET時，它們的熒光發生猝滅。即一個熒光團可以作為另一個熒光團的猝滅基團。而當向探針D-TMSPB溶液中加入硫醇后，可使得探針的二硫鍵斷裂，進而產生新的二硫鍵，形成TMSPB，即連接體的破壞使兩個熒光團擴散分開，繼而導致FRET的終止和熒光強度的增強。

圖3 基于FRET機理的熒光探針結構式

2.2 HClO熒光探針的研究

HClO是生物體內不可缺少的活性氧(ROS)物質之一。近年來，隨著熒光探針技術的不斷發展，其操作簡單、靈敏度高以及特異選擇性好等優勢在臨床檢測中得到了廣泛的普及和應用，并且在體內HClO的檢測中取得了較好的應用成效。

2.2.1 基于對氨基酚的HClO熒光探針

2019年，Liu課題組[19]開發了一種新的探針HCA-Green(圖4)。該探針使用4-溴-1,8-萘酰亞胺再結合對氨基酚，從而產生PET效應，熒光微弱。對氨基酚作為識別基團，當加入HClO后，苯酚基被切去，從而破壞了PET效應，生成發綠色熒光的MNA，使探針表現出顯著的熒光強度增強，MNA作為一種理想的雙光子熒光基團，具有較大的Stokes位移和光穩定性好的優點。該探針實現了對HClO的高特異性和超靈敏的熒光響應。從而提高了在單光子和雙光子激發下，探針對HClO的靈敏度。

圖4 探針HCA-Green檢測HClO結構式

2.2.2 基于硒化物的HClO熒光探針

2020年，Jing課題組[20]設計了一種內質網靶向性的可逆熒光探針(ER-Se)(圖5)。該探針是基于硒作為識別基團，當加入HClO后，實現對硒原子的氧化，使得熒光減弱，而當加入GSH后，由于GSH強的還原性，故可將其還原為原探針ER-Se從而使熒光再次恢復。該探針不僅具有可逆能力而且對HClO顯示出高靈敏度和良好的選擇性。此外經實驗表明，該探針還具有很強的內質網靶向性的能力。

圖5 探針ER-Se檢測HClO機理結構式

2.2.3 基于肟化物的HClO熒光探針

2013年，Zeng課題組[21]設計并合成了一種基于BODIPY的熒光探針(bod-oxime)，如圖6所示。該探針以肟基作為識別位點，引入肟基后，由于C=N異構化引起的激發態衰減過程，使探針不發熒光，而當加入HClO后，發生脫肟反應，氧化生成醛基，從而恢復了BODIPY熒光基團的綠色熒光。由于該探針結合有親水性羧基和羥基部分故其具有高度水溶性，而且其對HClO較高的靈敏度和選擇性可用與檢測水介質中的HClO和活細胞成像。

圖6 探針bod-oxime檢測HClO機理結構式

2.2.4 基于雙鍵氧化裂解的HClO熒光探針

2020年，Yin課題組[22]構建了一個用甲氧基取代喹啉偶聯二氰基異氟酮的探針(QI)(圖6、圖7)。該探針采用雙鍵作為HClO的反應位點，通過喹啉和甲醇之間的雙重協同作用使雙鍵穩定，其中二氰基和吡啶N為吸電子基團，甲氧基為供電子基團，甲氧基與吡啶N之間的“推拉”電子效應導致C=C鈍化。同時相反的是，另一種C=C雙鍵被二氰基的強電子拉力效應所激活。引入HClO后，可使得二氰基雙鍵發生氧化裂解生成羰基，從而可以實現對HClO的特異性檢測。

圖7 探針QI檢測HClO機理結構式

2.2.5 基于對甲氧基酚的HClO熒光探針

2014年，Yang課題組[23]報道了HKOCl-2系列的新型熒光探針(圖8)。該系列探針以對甲氧基酚為識別位點，探針HKOCl-2由于PET效應而基本不發熒光，當引入HClO后，對甲氧基苯酚可氧化為對苯醌類，且正鹵素取代類似物(X=F,Cl)被設計用來進一步阻斷苯醌產物的氧化，從而消除PET效應，使得熒光由無色變為亮綠色。同時該探針對HClO具有良好的選擇性、敏感性和化學穩定性。

圖8 探針HKOCl-2檢測HClO機理結構式

2.2.6 基于硫族化合物的HClO熒光探針

2021年，Zhou課題組[24]制備了一種新型的基于香豆素的熒光探針 Cou-HClO，用于基于HClO介導的氧化脫保護機制檢測HClO(圖9)。此探針是通過香豆素衍生物和巰基乙醇的簡單縮合獲得的。且該探針在沒有HClO的情況下，本身表現出基于香豆素而發出強烈的綠色熒光。但與HClO反應后，此探針的熒光顯著降低。且此探針表現出優異的選擇性和靈敏度(檢測限為16 nM)和5s內的快速響應。該探針不僅可用于對各種細胞中的外源性HClO進行成像，還可以確定炎癥期間巨噬細胞中HClO的波動水平。2019年，Wang課題組[25]構建了一種基于酚噻嗪為母體的新型快速響應雙光子熒光探針NS-ClO，可用于對活細胞、組織和新鮮斑馬魚中的內源性HClO進行成像。該探針NS-ClO是通過將苯并噻唑引入吩噻嗪中而開發的(圖10)，其中硫原子作為HClO的識別位點。由于吩噻嗪中的硫原子對HClO具有很強的反應性，因而當加入HClO后可將吩噻嗪中的硫原子氧化為亞砜，并發射出綠色的熒光。且苯并噻唑也是一種常見的吸電子基團，在氧化和還原條件下都很穩定，故進一步確保了所構建的探針在過量的HClO中的穩定性。而且其還具有大的開啟信號(約860次)和大的斯托克斯位移(約90 nm)以及對HClO的良好的選擇性；因而此探針可作為檢測HClO的一個工具。

圖9 探針 Cou-HClO檢測HClO結構式

圖10 探針NS-ClO檢測HClO結構式

2020年，Ma課題組[26]構建了一種用于測定HClO的新型網狀靶向和比率熒光探針(圖11)。該探針以4-氨基萘酰亞胺為熒光基團，以(2-氨基乙基)硫脲基團為特異性識別單元，以對甲苯磺酰胺基團為內質網定位基團。當HClO不存在時，探針通過分子內電荷轉移(ICT)過程從而顯示出綠色熒光。而在HClO存在下，ICT的過程受到抑制，進而導致熒光發生了藍移變成了淺藍色。其設計的比率熒光探針對HClO表現出高靈敏度和選擇性。而且該比率型熒光探針可在很寬的pH范圍內工作，熒光強度比對HClO濃度呈現良好的線性響應。此外，該探針顯示出優異的內質網靶向能力，已成功應用于PC-12細胞內質網中HClO的共聚焦成像，幾乎沒有細胞毒性。從而可用于檢測活細胞內質網中的HClO。

圖11 基于硫脲識別位點檢測HClO熒光探針結構式

2.2.7 基于其他識別基團的HClO熒光探針

2020年，Chang課題組[27]設計了一種基于羅丹明為母體的單分子熒光探針(ZED)(圖12)。該探針可以同時檢測細胞中的半胱氨酸/同型半胱氨酸、次氯酸、線粒體膜電位及線粒體通透性轉變。該探針是由NBD、香豆素、咪唑鹽和羅丹明四個部分連接組成，用與感知Cys/Hcy、線粒體狀態和HClO。對檢測Cys與Hcy因篇幅原因暫不贅述，當探針(ZED)直接加入HClO后，可將咪唑鹽與羅丹明連接部分切斷，進而生成發紅色熒光的羅丹明B；而在探針(ZED)加入GSH后，可將NBD與香豆素之間的C-O鍵切斷，而生成中間產物ZED-1,再次引入HClO后，又將咪唑鹽與羅丹明連的接部分切斷，一部分生成以香豆素熒光團為主體且發藍色熒光的產物ZED-2，而另一部分為發紅色熒光的羅丹明B，從而實現對HClO快速、有選擇性、高靈敏度的識別。

圖12 探針ZED檢測HClO機理結構式

2020年，Wei課題組[28]成功地開發出以亞甲基藍(MB)作為熒光團的可活化熒光探針(圖13)。該探針最大的優點在于可完全溶于水，而亞甲基藍MB也是一種很好的光聲(PA)成像試劑，可用與光動力學治療[29]。在加入HClO后可將羰基切斷，生成發深藍色光的亞甲基藍(MB)，進而表現出顯著的近紅外(NIR)發射和吸收變化，同時具有較高的選擇性和靈敏度，可實現對HClO特異性檢測。

圖13 基于MB為母體探針檢測HClO結構式

2021年，Wang課題組[30]開發了一種新的基于喹啉的熒光探針(HQ)(圖14)用于檢測和可視化類風濕性關節炎(RA)模型中的HClO介導的炎癥反應。該探針HQ具有供體-π-受體 (D-π-A) 結構，即該結構是由對羥基苯甲醛(電子供體)與1-乙基-4-甲基碘化喹啉(電子受體)通過 C=C雙鍵連接而成，且發橙黃色熒光。當HClO存在時，帶有羥基苯的探針(HQ)會被氧化為苯醌而導致吸收光譜紅移，進而使得熒光發射強烈猝滅。此探針HQ具有高靈敏度和選擇性、快速響應和良好的生物相容性等特點，因而可用作監測小鼠模型中HClO介導的RA治療反應的工具。

圖14 探針HQ檢測HClO機理結構式

3 結 語

熒光探針用于生物體內活性氧化物的檢測具有選擇性高、生物相溶性好以及檢測限低優點。這技術已廣泛應用于在生物學和環境監測領域。近年來，各種基于新設計理念及新反應識別位點的新型HClO探針層出不窮，發展迅猛。但仍然存在一些亟需解決的關鍵問題，如靶向效果不夠顯著、靶向精準度有待提高、探針的使用過程中易受到假陽性信號干擾，在生物體內易受其他活性氧分子干擾等，開發響應靈敏度高、速率快、熒光發射波長位于近紅外區域且切實能應用于深層組織或器官的HClO熒光探針是未來的發展趨勢。