羅丹明熒光探針研究進展*

陳志鵬，盛家榮

(南寧師范大學 化學與材料學院，廣西 南寧 530100)

0 引言

化學熒光探針已有100多年歷史了。當前，常用于生物體內活性物質檢測的方法有：毛細管電泳法[1-2]、質譜法[2-3]、高效液相色譜法等[4]，但這幾種方法檢測過程復雜，選擇性較差，對比這些方法，熒光探針法是將化學信號轉化為光信號，從而達到對生物系統進行檢測，具有操作簡單，靈敏度高、選擇性好、易于進行功能化結構修飾，無需借助大型儀器，可以特異性的識別目標分子，實現非破壞性與可視化檢測等優點。目前熒光探針發展迅速，被廣泛應用于化學、生物、醫學、物理等[5]相關研究領域，在藥理及毒理分析、食品安全檢測、醫學診療和環境監測等[6-8]平臺扮演著重要角色，因此開發性能更具優良的熒光探針成為科研工作者的研究熱點。

1 熒光

較早的熒光的定義是指當紫外或可見光照射到某些物質后能夠再發射出波長和強度各不相同的光，停止照射光照射后，光線就會馬上或逐漸消失，這是一種光致發光的現象。隨著科學家不斷研究和探索，有關熒光的奧秘會被揭開。當熒光分子吸收一個或者多個光子后，熒光分子的外層電子從基態 S0躍遷到單重激發態(Sn)能級軌道，通過內轉換和振動弛豫釋放能量的方式，處在高能級的電子回到第一激發單重態(S1)的最低能級，第一單激發態再通過輻射躍遷的方式釋放出光子后回到基態(S0)，此時發出的光子稱為熒光。目前受到科學家們青睞的熒光團主要有香豆素類、1,8-萘酰亞胺、羅丹明、菁類、氟硼二吡咯(BODIPY)、呫噸類，這些熒光團都有著不同的激發和發射波長，一般都具有摩爾消光系數高、易于修飾、光穩定性好等優點[9]。

2 羅丹明概述

1905年，Noeleting 和 Dziewonsky 兩位科學家首次合成了羅丹明。羅丹明是一種以氧雜蒽為母體，不同的3，6位氨基取代的有機熒光染料，具有較深的顏色和很強的熒光。羅丹明類染料的吸收和發射波長隨著3,6位不同氨基的取代而變化，例如羅丹明B，6G，110和101(如圖1)在乙醇中的最大發射波長分別為568 nm，558 nm，524 nm，588 nm[10-12]。羅丹明染料具有高的熒光量子產率，高的摩爾消光系數和好的水溶性等光物理性質，且具有低的生物毒性，使其廣泛運用于生物標記和熒光探針等領域。

圖1 經典羅丹明結構式

羅丹明的內酰胺螺環的“開-關”互變的獨特結構引起了許多科學家的關注[13]。當羅丹明的內酰胺螺環處于閉環狀態時，它的溶液處于無色無熒光的狀態，而當它處于開環狀態時，會發出強烈熒光并且顏色鮮艷，這種獨特的性質給科學家帶來新的熒光探針的設計思路。

2.1 羅丹明探針用于檢測金屬離子

過渡金屬離子是自然界中不可缺少的成分，在許多生物體內參與各種必要的生理和代謝過程。一些過渡金屬在體內平衡的喪失會導致多種功能障礙或血液相關的疾病產生[14]。例如，Cu2+缺乏可導致生長衰竭和神經退行性疾病，而過高水平的Cu2+在生物過程中可導致嚴重綜合征，包括阿爾茨海默病，威爾遜氏病，和代謝紊亂[15-17]。此外，過量的金屬離子會造成環境污染，嚴重威脅了包括人類在內的植物、微生物和動物的健康，例如汞離子，含汞未經處理的污染物對環境和人體健康具有嚴重的影響[18-19]。

首次利用羅丹明開環反應檢測金屬離子的是在1997年，Czarnik的團隊[20]報道了一項利用羅丹明B衍生物檢測Cu2+的開創性工作，反應機理結構式見圖2。該團隊利用羅丹明B酰肼能夠特異性識別Cu2+而進行開環來進行檢測，當探針遇到Cu2+后，Cu2+促進羅丹明B酰肼水解成羅丹明B。該探針在pH為7的條件下可以在2 min內檢測到10 nM的Cu2+，此工作被報道后羅丹明的開環反應得到大量的關注。

圖2 首例檢測銅離子探針結構式

2020年，貴州大學的楊松課題組[21]報道了以羅丹明B為母體與2-氨基咪唑基團結合而成的六元環羅丹明探針probe 1和probe 2用于檢測銅離子反應機理結構式見圖3。與傳統的羅丹明五元環、六元環探針與金屬離子絡合的方式檢測相比，該探針是以銅離子誘導催化水解切斷C-C或者C-N耦合的方式來檢測銅離子。當探針進入體內后，探針首先被銅離子誘導C-C鍵裂解開環，而后誘導水解切斷C-N鍵使2-氨基咪唑基團離去，最終裸露出羅丹明B發出強烈熒光，最終達到檢測的目的。該方法檢測銅離子具有良好的選擇性和靈敏度，可達到皮摩爾級別的 LOD(35 pM)和納摩爾級別的靈敏度(80 nM)，為開發檢測金屬離子的羅丹明探針提供了新的設計思路。

圖3 檢測銅離子的羅丹明熒光探針結構式

2019年，山東第一醫科大學葛燕青課題組[22]報道了一種基于熒光共振能量轉移(FRET)的汞離子探針。該探針利用羅丹明的內酰胺螺環的“開-關”結構并引入咪唑并[1,2-a]吡啶基團設計開發了IP-Hg探針(圖4)。該探針本身由于羅丹明部分處于閉環狀態，產生FRET的效果非常低，此時在436nm處發藍色熒光。但是當IP-Hg探針與汞離子絡合后，探針的羅丹明部分絡合開環后與咪唑并[1,2-吡啶產生強烈的FRET效果，使得發射波長紅移在590 nm發出強烈的紅光，而在436 nm處熒光減弱，從而達到比率檢測汞離子的效果。該探針同時具有良好的選擇性和靈敏度，在入射光為370 nm時，F436/F590的線性可達0.998，表現出優良的線性效果，更值得一提的是它的斯托克斯位移可達220 nm,使得它具有良好的抗干擾性。

圖4 檢測汞離子的羅丹明探針結構式

2.2 羅丹明探針檢測pH

在生物體內每天都發生著各種復雜的反應，體內的pH 值也隨之不斷變化，pH的變化會與人體疾病的發生有著密切聯系，pH 值在體內過高或過低的表達都會對人體造成傷害,甚至引起細胞功能障礙,導致產生癌癥、心肺疾病、阿爾茨海默病等嚴重疾病[23]。由于羅丹明的內酰胺螺環在堿性條件下一般處于閉環狀態，沒有熒光，而在酸性條件下，處于開環狀態，發出強烈熒光，這為科學家們設計pH型響應探針提供了便利。

2017年，中國科學院王鵬飛課題組[24]報道了一款pH響應溶酶體靶向的近紅外熒光探針Lyso-hNR，結構式見圖5。該探針由對pH有著獨特響應的羅丹明衍生物的內酰胺螺環與溶酶體嗎啉靶向基團兩個部分組成，探針具有良好的溶酶體靶向功能。當探針聚集在生物體內中的溶酶體后，利用溶酶體的酸性環境使得羅丹明衍生物部分開環發出近紅外熒光，同時該探針具有非常優異的選擇性和靈敏度，并成功運用于生物體內溶酶體成像，從而檢測相關疾病的變化。

圖5 溶酶體靶向的pH響應型羅丹明探針結構式

經典羅丹明的缺點是斯托克斯位移小，使得羅丹明探針用于生物體內成像的時候因自吸收嚴重而導致信噪比差，檢出限低的情況?；诖?018年，Rudy Luck課題組[25]報道了一種具有大斯托克斯位移的近紅外pH響應的羅丹明探針,結構式見圖6。傳統經典羅丹明利用兩個取代氨基作為給電子基團，斯托克斯位移只有15～30 nm，該課題組通過引入一個喹喔啉衍生物來增加一個氨基來作為給電子基團，從而增強它的給電子能力，增大斯托克斯位移，改變其光譜性能，再引入鄰苯二胺作為pH響應位點合成探針。該探針的斯托克斯位移達到了67 nm,發射波長紅移到650 nm左右，擁有良好的靈敏度和信噪比。

圖6 具有大斯托克斯位移探針結構式

2019年，大連理工大學肖義課題組[26]報道了一種基于FRET機理測定炎癥巨噬細胞中溶酶體pH值的羅丹明探針，結構式見圖7。該探針以對pH響應靈敏度較高的羅丹明B為能量受體，利用可以溶酶體選擇的叔胺作為柔性連接基團與對pH不感冒的bodipy 為能量供體相結合，設計開發了BDP-RhB。該探針本身在518 nm處發出綠色熒光，當探針處于酸性條件下，羅丹明B衍生物部分開環與bodipy 形成FRET效果，波長紅移，在582 nm處發出強烈紅光，而518 nm處熒光減弱，從而達到pH比率檢測效果。此前該課題組利用一個剛性連接體設計開發了一款pH響應探針，它的FRET效率達到100%，探針受到pH響應后，bodipy 部分幾乎不發熒光了。而此次BDP-RhB 探針利用叔胺這樣的一個柔性連接基團，使得FRET效率下降到 95%，在pH響應后依然能夠發出微弱熒光，而叔胺在探針的堿性基團作用增強了對溶酶體的選擇性，達到了一個對溶酶體示蹤的一個效果。

圖7 基于FRET 機理pH響應羅丹明探針結構式

2.3 檢測生物體內活性氧的羅丹明探針

近年來，活性氧物質的檢測一直是科研人員關注的熱點，雖然活性氧普遍存在于生物體內，但由于它的量非常低，一般都是微摩爾級別甚至更低，而且活性氧物質活性非常高，因此當它形成后立馬就與附近的物質發生反應而消失了，大大增加了檢測難度。在生物體內含氧的中間體、中間代謝產物以及含氧自由基和氧的衍生物統稱為活性氧，主要包括單線態氧、次氯酸、過氧亞硝根、過氧自由基、超氧負離子、過氧化氫、羥基自由基等，活性氧在生物體內是不可或缺和替代的物質，它的正常表達可以維持機體的穩態和信號的傳遞，一旦失衡將會導致線粒體、溶酶體和高爾基體等多種細胞器的損傷，進一步導致疾病的發生[27-28]，因此開發檢測ROS的羅丹明探針具有重要意義。

2017年，東南大學錢鷹課題組[29]報道一款基于FRET模式檢測次氯酸的雙光子比率型熒光探針RHSDN,結構式見圖8，該探針是將羅丹明-氨基硫脲和吡啶-萘酰亞胺通過苯基間隔連接，探針本身因羅丹明部分處于閉環狀態，FRET效果被抑制，探針溶液處于無色綠色熒光的狀態，當RHSDN與次氯酸進行脫硫環化反應后，RHSDN的羅丹明內酰胺環被打開與萘酰亞胺形成FRET效應，此時萘酰亞胺作為能量供體，將能量轉移至羅丹明，綠色熒光強度降低，波長發生紅移，轉而發出強烈的紅色熒光，此時溶液處于紅色，從而達到比率檢測次氯酸的效果并且可以用肉眼到顏色變化，非常直觀。同時該探針選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強，檢出限低至9.6×10-8M。

圖8 檢測次氯酸機理結構式

目前大多數的熒光探針都會存在一定的ACQ效應，在生物體內生理溶液條件導致熒光減弱甚至猝滅，羅丹明熒光探針也不例外。為了解決這一問題，2018年,唐本忠課題組[30]開發了一款具有AIE效應同時能檢測生物體內次氯酸的羅丹明熒光探針TPE-RNS，結構式見圖9。該探針是以羅丹明B為母體通過引入四苯基乙烯作為轉子來產生AIE效應，進入異硫氰酸苯酯作為次氯酸的識別位點。探針本身在聚集態下只有TPE的藍色熒光當探針進入生物體內被次氯酸氧化開環后，藍色熒光迅速減弱，發射波長紅移轉而發出橙紅色熒光，并且該探針不僅可用于活細胞內源性次氯酸的比例成像，而且能夠靈敏地區分癌細胞和正常細胞。

圖9 具有AIE效應檢測次氯酸羅丹明熒光探針結構式

2021年，西北大學楊小峰課題組報道一種以依達拉奉為誘導的檢測羥基自由基(·OH)的羅丹明熒光探針RH-EDA(如圖10)，依達拉奉是一種目前治療腦梗塞中風的腦保護劑，也是自由基清除劑，依達拉酮可以與·OH相互作用生成穩定的氧化產物OPB[31]。作者在羅丹明B的母體中引入一個類似于依達拉酮的結構作為·OH識別位點，由于TICT的作用RH-EDA本身是無熒光的，在其進入生物體內后與· OH相互作用生成穩定的產物RH-OPB，同時TICT效果消失，探針發出羅丹明B的強烈熒光，從而達到檢測的目的。但由于生物體內存在多種自由基，目前還不能排除其他自由基的影響，基于此還可以開發出更優良的熒光探針。

圖10 依達拉酮誘導檢測羥基自由基結構式

當前，已有文獻報道了大量的檢測活性氧物質的羅丹明熒光探針，但是還少有能夠同時檢測兩種活性氧物質的羅丹明熒光探針。2022年，仉華、李平等[32]報道了一種雙通道檢測過氧亞硝酸鹽(ONOO-)和三磷酸腺苷(ATP)的羅丹明探針，結構式見圖11。該探針主要由羅丹明B衍生物和1,8-萘酰亞胺兩個熒光團組成。

圖11 同時檢測ATP和ONOO-結構式

通過在1,8-萘酰亞胺上引入一個硼酸酯基團作為ONOO-特異性識別位點，羅丹明B的螺環內酰胺結構作為ATP的識別位點。當探針進入生物體內后，只遇到ATP時，ATP誘導羅丹明B開環，在580 nm左右出發出紅色熒光，達到檢測ATP的效果；當只遇到ONOO-時，1,8-萘酰亞胺上的硼酸酯被氧化斷裂成羥基，此時羅丹明B部分沒有熒光，只在562 nm處發出黃色熒光，達到單獨檢測ONOO-的效果；當兩者同時存在時，兩個熒光團同時被打開，可以在紅色和綠色通道同時檢測，達到同時檢測ATP和ONOO-的效果。該探針已經運用到生物細胞層面上，在HL-7702 細胞中加入APAP誘導模擬肝毒損傷，此時ATP被消耗和ONOO-水平增高，與正常細胞相比，可以看到在綠色通道熒光明顯減弱，在紅色通道熒光增強，基于此可利用該探針來觀察到疾病的變化趨勢。

2.4 羅探明探針用于醫學診療

在生物體內的生理和病理過程中ROS的濃度是不斷變化的，在低水平的時候可以通過激活多種信號通路來調節細胞增殖和分化等重要的生物過程，ROS的過量產生可導致細胞死亡或通過氧化應激過程促進腫瘤的增殖。此外，很多報道表明，與正常細胞相比，一些癌細胞的ROS應激水平顯著升高，因此越來越多的科學家利用ROS作為開關去對一些疾病進行診療[33-35]。

在癌癥診療過程中藥物一般在運輸過程中就被消耗很多，導致到達病變位置的藥物少之又少，藥效達不到最好，因此開發針對癌癥腫瘤的前體藥物迫在眉睫。2020年，Avijit Jana 等[36]開發了一種定位于線粒體的基于羅丹明的水溶性良好的光籠，結構式見圖12，并且由體外綠光觸發的具有特異性、腫瘤細胞選擇性的熒光探針，羅丹明B的還原態是沒有熒光的而被生物體內的ROS氧化后能夠再次發出紅色熒光，作者通過引入治療癌癥效果非常的苯丁酸氮芥合成探針HRhod-cbl；HRhod-cbl的診療機理是：該探針進入生物體內后，被腫瘤細胞的線粒體中異常高水平的ROS氧化后生成羅丹明的活性光籠，此時探針都聚集在腫瘤細胞的線粒體中，再由體外用綠光激發活性羅丹明光籠，誘導釋放出抗癌藥物苯丁酸氮芥，該探針實現了對腫瘤細胞的精準打擊，大大提高了抗癌藥物的藥效，為前體藥物的開發提供了新思路。

圖12 作為藥物載體的羅丹明探針結構式

除了抗癌藥物難以達到病變組織這一難題，還有如何區分癌變細胞和正常細胞也是一大難題。 為了解決這一難題很多科學家都已經進行相關報道，2021年山西大學郭煒課題組提出了通過一種b-Lap 抗癌藥物增大腫瘤細胞的ROS水平，結合能夠特異性識別ROS的具有近紅外發射的硅羅丹明探針對癌變細胞與正常進行區分的策略[37]。作者將經典的硅羅丹明引入一個吡咯衍生物合成了探針PSiR，結構式見圖13。該探針由于吡咯與硅羅丹明母體的PET機制是無熒光的，當與ROS結合后，吡咯上的氮氫被氧化成羥基，抑制了PET效應，發出紅色熒光，b-Lap可以導致大量的DNA氧化損傷的腫瘤細胞迅速生成大量的細胞內ROS，此時ROS的水平異常高，因此癌變細胞的熒光要比正常細胞區域要強很多，從而達到區分的效果。

圖13 可以區分癌變細胞和正常細胞的硅羅丹明探針結構式

3 結語

羅丹明染料是光譜性能優良的有機染料之一，有著近紅外的激發波長與發射波長以及獨特的螺環結構作為熒光探針的開關；而熒光探針是檢測生物體內各種物質的主要手段之一，具有響應快、選擇性好、檢測限低等優點， 所以開發不同性能的羅丹明熒光探針有著深遠的意義。但是目前羅丹明熒光探針開發還有很多難題，例如常用的羅丹明的斯托克斯位移小,單通道檢測、檢測物質單一、發射波長短，難以克服熒光的ACQ效應等缺點，這樣在檢測成像時容易造成強的背景光干擾、分辨率低、清晰度差、組織穿透能力差導致羅丹明探針不能廣泛利用于生物成像領域，因此開發性能更為優異的羅丹明熒光探針的還有著巨大前景。