直接進樣紫外指紋圖譜結合化學計量學鑒別南、北五味子

陳 娟，周娟娟，秦亞東

（1.安徽中醫藥高等?？茖W校附屬醫院/蕪湖市中醫醫院 制劑室，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽師范大學 生命科學學院，安徽 蕪湖 241002；3. 安徽中醫藥高等?？茖W校 藥學系，安徽 蕪湖 241002）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill. 的干燥成熟果實，主要分布在我國東北地區，又稱北五味子。南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils. 的干燥成熟果實[1]，主要分布在我國山西、河南、安徽等地，又稱華中五味子。歷史上，南、北五味子作為不同來源的同一味藥材收載和臨床應用。自1995 年版《中國藥典》起，南、北五味子作為兩味藥材進行收載，兩味藥材味酸、甘、溫，歸肺、心、腎經，均具收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功。南、北五味子為同科同屬植物，在外觀性狀、顯微特征方面較為相似[2-3]，為鑒別帶來了困難，加上野生北五味子價高量少，導致市場上時常有混用、摻入現象，因此，急需建立一種快速可靠的鑒別方法。

近年來，基于薄層色譜[4]、液相色譜[5-7]、紅外光譜[8]、液質聯用[9-11]等現代分析技術研究顯示，以五味子醇甲、五味子酯甲等為代表的木脂素類化學成分在南、北五味子中存在著顯著差異，可以作為識別標記物或質量標記物，從而達到二味藥材鑒別的目的。課題組曾報道過南、北五味子液相色譜指紋圖譜結合化學計量學手段對比分析研究，結果也表明五味子醇甲、五味子酯甲等為代表的木脂素類化學成分是南、北五味子主要差異性成分。2020 年版《中國藥典》（一部）中明確規定了南、北五味子的定量指標分別為五味子醇甲和五味子酯甲，現代分析研究結果驗證了《中國藥典》定量指標設置的合理性。除上述方法外，基于藥材顏色、氣味、味覺、二維熒光光譜[12]和DNA 指紋圖譜[13]等技術均可成功鑒別南、北五味子，然而這些方法往往試劑消耗大、分析時間長。

直接進樣紫外（Flow-injection ultraviolet spectroscope,FI-UV）指紋圖譜利用HPLC 技術，不經過色譜柱分離，只經過一根長度為5 mm 的保護柱（僅起到粗分和保護檢測器功能）。相對于HPLC 指紋圖譜，FI-UV 的突出優勢是分析時間短（1 ～2 min/樣），尤其適合大批量樣品測試，目前國內未見文獻報道。通過設置二極管陣列檢測器（DAD）相關參數，以總紫外吸收、紫外光譜等為數據源繪制吸收曲線，可以直觀地分析藥材質量，達到可視化快速鑒別的目的；同時結合化學計量學手段，可以快速篩選關鍵變量[12-13]，避免主觀判別造成的誤差。FI-UV 與HPLC 指紋圖譜相比優勢十分明顯，具有簡單、快速的顯著特點。本研究采用FI-UV 指紋圖譜技術結合化學識別模式快速鑒別南、北五味子，為其分類鑒別提供了一種新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1290 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；FA1204 型精密電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；JK-250DB 型超聲波清洗儀（合肥金尼克超聲波清洗機廠）；Minispin 型臺式離心機（北京宏達恒業科技有限公司）。

1.2 試藥

南、北五味子藥材采購于安徽省亳州市康美中藥材大市場及藥店，北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（SCB）的 干 燥 成熟果實，南五味子為木蘭科植物華中五味子Schisandra sphenantheraRehd. et Wils.（SSW）的干燥成熟果實，均經安徽中醫藥高等?？茖W校附屬醫院/蕪湖市中醫醫院中藥材炮制中心祁俊主任中藥師鑒定，樣品信息見表1。藥材粉碎后，過60 目篩，密封于EP 管中，置4 ℃冰箱中存儲備用。乙腈、甲酸為色譜級（TEDIA，USA）、水為實驗室自制超純水、甲醇為分析純。

表1 樣品信息Tab. 1 Information of test sample

2 方法和結果

2.1 紫外指紋圖譜條件

2.1.1 色譜條件 安捷倫保護柱：Agilent Zorbax SBC18柱（5 mm × 2.1 mm, 1.8 μm）；流動相：乙腈-水溶液（50 ∶50 / V ∶V），等度洗脫；流速：0.15 mL/min；進樣量：1 μL；檢測波長：254 nm。

2.1.2 檢測器條件 設置DAD 檢測器響應值：20 Hz，采集頻率：0.05 s/次，掃描范圍：190 ～400 nm，步進值：1 nm，進樣量：1 μL。

2.2 供試品處理方法

樣品粗粉過60 目篩，經恒溫干燥至恒重后，精密稱取五味子粉末 0.100 0 g,置15 mL 具塞離心管中，加入50%甲醇-水（V ∶V）溶液10 mL，超聲1 h 后離心處理（3 000 r/min）15 min，上層溶液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，備用。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法制備供試品1 份，按“2.1”項下條件連續進樣6 次，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，經多點校正、自動匹配，結果相似度均大于0.982，說明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法條件制備供試品6 份，按“2.1”項下條件分別于0、2、4、8、12 h 進樣，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，結果相似度均大于0.965，說明樣品在12 h 內穩定。

2.3.3 重復性試驗 以SCB1 樣品為考察對象，按“2.2”項下方法條件，制備供試品溶液6 份，按“2.1”項下條件分別進樣，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，結果相似度均大于0.977，說明該方法重復性良好。

2.4 直接進樣紫外指紋圖譜

2.4.1 總紫外吸收指紋圖譜 所有供試液經液相色譜儀自動進樣1 μL，通過C18保護柱，不經色譜柱分離直接進入DAD 檢測器，按“2.1”項進行參數設置，每個樣品平行進樣 3 次。11 批 SCB 樣品和11 批 SSW 樣品的FI-UV 指紋圖譜，見圖1。直觀分析可見，SCB 和SSW 樣品的總吸收指紋圖譜輪廓明顯不同，其中，SCB 樣品（圖1A）在保留時間約0.13 min 處的吸收明顯小于SSW 樣品（圖1B）；在保留時間約0.25 min 處，SCB 樣品的吸收明顯高于SSW 樣品，SSW 樣品保留時間約0.25 min 處幾乎無吸收；除此之外，在保留時間約0.49、0.61 和0.89 min 處，SCB 和SSW 樣品吸收呈現明顯不同。

圖1 北五味子（A）和南五味子（B）總紫外吸收指紋圖譜（n = 33）Fig. 1 Total absorbance chromatograms of SCB（A） and SSW（B）（n = 33）

2.4.2 紫外光譜指紋圖譜 充分利用DAD 檢測器性能和挖掘“海量”數據內在隱藏信息，使得到的紫外光譜指紋圖譜更加穩定可靠。對比SCB 和SSW 樣品總流出曲線圖，直觀可見，在保留時間為0.13 min（色譜峰1）和0.25 min（色譜峰2）處，SCB 和SSW明顯不同。因此，對保留時間為0.13 min 和0.25 min處產生的“色譜峰”頂點處的平均紫外掃描光譜（190 ～400 nm）數據進行提取、導出、合并，結果如圖2 所示。直觀分析可見，保留時間約0.13 min處色譜峰的平均紫外光譜（圖2A、圖2B）較為相似；保留時間約0.25 min 處色譜峰的紫外光譜輪廓呈現不同特點（圖2C、圖2D），在211、253 nm 附近SSW 樣品出現2 個明顯的吸收峰，明顯強于SCB樣品在211、253 nm 產生的吸收，且SSW 樣品在保留時間約0.25 min 處色譜峰的紫外光譜強度整體上明顯強于SCB 樣品。

圖2 北五味子和南五味子紫外光譜指紋圖譜Fig. 2 Ultraviolet spectra for SCB and SSW

2.5 多元統計分析

2.5.1 PCA 分析 為更加客觀地分析南、北五味子FI-UV 的差異性，將總紫外吸收指紋圖譜（0 ～2 min）數據導出、合并，以響應值為變量，經Log 轉換和UV Scaling 處理后，每個樣本總紫外吸收有2 401 個數據采集點、第一“色譜峰”和第二“色譜峰”頂點處紫外光譜有211 個數據采集點。分別對由 2 401 ×125 形成的數據矩陣和211 × 125 形成的數據矩陣，共66（22 × 3）個樣本進行無監督主成分分析（PCA），結果見圖3。以總流出曲線進行PCA 分析，SCB 和SSW 兩組樣品可獲得良好的分類（圖3A），所有SCB 樣品均分布在t[1]象限正值區域，所有SSW 樣品均分布在t[1]象限負值區域；以第一“色譜峰”頂點處紫外光譜進行PCA 分析，同樣獲得良好的區分效果（圖3B）；以第二“色譜峰”頂點處紫外光譜進行PCA 分析，分類效果不理想（圖3C）。

圖3 北五味子與南五味子樣品PCA 得分圖Fig. 3 Principal component analysis score of SCB and SSW sample

2.5.2 PLS-DA 分析 在第一色譜峰頂點光譜指紋圖譜無監督PCA 分類信息的基礎上，為繼續縮小組內差異，使組間差異最大化，以光譜指紋圖譜 190 ～400 nm 的211 個數據點的響應值為變量，對66（22 ×3）個樣本進行偏最小二乘回歸分析（PLS-DA）。3

南、北五味子所處象限范圍與PCA 分析相一致，組內差異變小，組間差異擴大，見圖4。由圖4 可知，SCB 樣品分布在t[1]負值區域，SSW 分布在t[1]正值區域，南、北五味子樣品可以達到較好的區分效果。PLS-DA 分析與PCA 分析雖然結果類似，但與PCA 分析結果相比，組內的分布更為集中。PLS-DA作為有監督的分類模式，通過縮小組內差異和組間差異的最大化，該模型R2X= 0.993，R2Y= 0.988，Q2=0.988，表明該模型穩定性好，預測能力強。

圖4 北五味子與南五味子樣品PLS-DA 得分圖Fig. 4 PLS-DA score of SCB and SSW sample

211、240、253、287 nm 對SCB 和SSW 的區分起到主要作用，結合變量的VIP 值大于1 的原則，211、240、253 nm 對南、北五味子的分類起到關鍵作用，說明這3 個波長對應的響應值對3 個屬的五味子區分起到重要作用；考慮到211 nm 靠近紫外末端吸收，可能存在非小分子有機化合物產生信號，如多糖的特征吸收在190 nm 附近，信號的波動較大，見圖5。因此，綜合考慮240、353 nm 對區分SCB 和SSW 樣品起到決定作用。分別以211、240、253 nm；240、253 nm 變量為數據源進行PCA 分析，結果見圖6。

圖5 北五味子與南五味子樣品平均紫外光譜和變量系數圖Fig. 5 Averaged UV spectra and variable coefficient of SCB and SSW sample

圖6 北五味子與南五味子樣品在不同波長紫外吸收PCA 得分圖Fig. 6 SCB and SSW sample's PCA score of UV spectra absorption in different wavelength

由圖6 可知，SCB 和SSW 樣品區分效果較好。SCB 樣品分布在t[1]象限負值區域，遠離SSW 樣品；SSW 樣品分布在t[1]象限正值區域。說明變量211、240 和253 nm 對SCB 和SSW 樣品的分類起到重要作用，尤其是240、253 nm 變量對它們的分類起到決定作用。

3 討論

不同產地、采收季節、種屬、炮制工藝等來源的中藥，其內在質量通常存在差異性。在中藥鑒別方面，液相色譜指紋圖譜能夠全面地反映樣品的信息，給出更多化學成分信息，但傳統液相色譜指紋圖譜在中藥鑒別領域往往需要更多的分析時間、消耗更多的試劑。FI-UV 指紋圖譜雖不能提供具體化合物的相關信息，但能從整體對南、北五味子進行快速鑒別，同時FI-UV 最顯著優勢在于分析時間短，每個樣品僅需要1 ～2 min，尤其適合大量樣品測試；且利用液相色譜儀的性能，使得紫外光譜具有較高的穩定性；樣品前處理簡單，節約試劑。

紫外光譜指紋圖譜在中藥質量評價、產地鑒別等領域已有學者進行有益探索[7]，但未進行深入挖掘。由于采樣較為困難，本研究僅對收集到的11 份北五味子和11 份南五味子藥材進行FI-UV 測試，其總紫外吸收圖譜和紫外光譜圖輪廓明顯不同。進一步利用化學統計學手段，充分挖掘大量變量隱藏信息，PCA、PLS-DA 分析結果并結合變量VIP 值及紫外吸收特征顯示：對北五味子和南五味子藥材分類起重要作用的變量為211、240 和253 nm，考慮到211 nm接近紫外的末端吸收，干擾比較多，進一步以240 和253 nm 為變量進行無監督PCA 分析，依然能夠取得理想的鑒別效果。FI-UV 從整體角度反映了北五味子與南五味子藥材的化學成分存在明顯的差異，為五味子類藥材及其它中藥資源的快速鑒別及內在質量控制提供參考和借鑒。

4 結論

本研究建立的南、北五味子FI-UV 指紋圖譜方法，能夠快速準確鑒別南、北五味子，從整體層面反映兩種來源五味子的差異性，同時結合化學計量學方法能夠避免傳統性狀鑒別的主觀性。該方法分析速度快、穩定性和重復性良好、操作簡便易行，為不同來源的五味子類藥材的鑒別提供了新的參考方法，對藥材科學鑒別起到促進作用。