金盞花精油的微波輔助提取及其成分與抗氧化活性研究

劉 歡，趙巨堂，何 力，羅海濤，熊文俊，鄒恩凱,

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047；2.江西中煙工業有限責任公司，江西南昌 330096）

金盞花（Calendula officinalisL.）是菊科金盞菊屬植物，別名金盞菊、盞盞菊等。其在世界各地均有廣泛種植，尤其以歐洲及美國為主[1]，目前在國內主要分布于四川、安徽、廣西、廣東等地。金盞花中不僅含有糖類、脂肪、氨基酸等基本營養物質[2]，還富含類胡蘿卜素、類固醇、三萜皂苷、黃酮等有效成分，具有很強的健胃、收斂、止血和愈傷的功效，此外還有抗炎、抗腫瘤、免疫調節和促進細胞再生等藥理作用[3?4]。精油作為金盞花中主要活性組分之一，其優異的抗菌、抗氧化等功效，正受到消費者及研究人員的關注。

水蒸氣蒸餾法是提取精油最為常用的方法之一，可以較好地保留原料的香氣，且工藝及設備都較為簡單，但耗時長，能耗高。近年來微波輔助法以其快速省時、節約能耗的特點在植物精油的提取中廣泛應用，并取得了較好效果，微波輻射所產生的熱效應和非熱效應都可以加速活性物質的溶出，從而使目標產物得率上升，而且不會改變精油的成分組成[5]。很多研究者利用微波輔助水蒸氣蒸餾法對許多植物原料的精油進行了提取。楊婷等[6]采用微波輔助水蒸氣提取法對香桂葉精油進行了提取，經過優化后得率達到了4.43%，與單一水蒸氣提取相比得率上升了0.14%，同時達到了減少耗時、提高效率的目的。李曉嬌等[7]利用微波結合水蒸氣蒸餾法提取的清香木葉精油得率最高可達到2.09%，對比超聲波輔助法（1.78%）和蒸餾萃取法（0.93%）精油得率顯著提高。Farhat等[8]利用微波蒸氣擴散法提取橙皮精油，與普通蒸餾法相比得到了相似的得率，但是極大縮短了提取時間，而且含有相同數量的揮發性次生代謝物，且產率相近。綜上，微波輔助水蒸氣蒸餾法是一種綠色、高效的精油提取方法。

目前，關于金盞花精油的研究多集中在化學成分的鑒定和比較，而有關其工藝和抗氧化活性的研究還不充分。本研究在傳統水蒸氣蒸餾法基礎上結合微波輔助，以干燥的金盞花為原料，優化了制備金盞花精油的三項關鍵工藝參數，并用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法對金盞花精油的化學組分及含量進行鑒定分析，檢測了其體外抗氧化性。本研究將為金盞花精油的大規模生產提供較為可靠的工藝參數，并為探索其作為天然抗氧化劑的潛力提供理論依據及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金盞花花瓣 產自內蒙古，亳州市連銳商貿有限公司；無水硫酸鈉、水楊酸、30%過氧化氫、過硫酸鉀、抗壞血酸、氯化鈉、正己烷、無水乙醇、七水合硫酸亞鐵（均為分析純） 西隴科學股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2 ,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）（均為分析純） 索萊寶生物科技有限公司。

GZX-9420 MBE鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；DFY-500中藥粉碎機 大德中藥機械有限公司；KE-52AA旋轉蒸發器、SHZ-III型循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Agilent7890-7000A氣相色譜-三重串接四極桿質譜聯用儀 美國安捷倫科技有限公司；ZNHW型智能恒溫電熱套 上海錦岐儀器設備有限公司；LE2202E電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司；U-T6紫外可見分光光度計 屹譜儀器制造有限公司；BD/BC-218E冰柜 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；WBFY-205型微波化學反應器 上海秋佐科學儀器有限公司；VORTEX 3旋渦振蕩器 艾卡（廣州）儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金盞花精油的提取 參考段賓賓等[9]的提取方法并做出一些改動：將干燥的金盞花粉碎，過60目篩子，得到金盞花粉末。量取50 g金盞花粉末于5000 mL燒瓶中，加水后經微波加熱再進行水蒸氣蒸餾，探究提取時間（2、3、4、5、6 h）、NaCl質量濃度（1%、2%、3%、4%、5%）、料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）、微波功率（80、240、400、640、800 W）、微波時間（2、4、6、8、10 min）五個因素對精油得率的影響，蒸餾結束后用10 mL正己烷把上層金黃色的金盞花精油萃取出來放入50 mL離心管，然后加入適量無水硫酸鈉，再放入?18 ℃的冰箱冷凍8 h，將固體濾除后減壓蒸發，即得金盞花精油。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取時間對精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照1:40 g/mL料液比與水混合再加3%質量濃度的NaCl，經過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取一定時間，后續操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在2、3、4、5、6 h的蒸餾時長下產量的變化。

1.2.2.2 NaCl濃度對精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照1:40 g/mL料液比與水混合再加一定量的NaCl，經過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取4 h，后續操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在1%、2%、3%、4%、5%質量濃度的NaCl條件下產量的變化。

1.2.2.3 料液比對精油得率的影響 將50 g金盞花粉置于蒸餾燒瓶中，按照一定料液比與水混合再加3%質量濃度NaCl，經過6 min功率為400 W的微波輻射后蒸餾提取4 h，后續操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL料液比條件下產量的變化。

1.2.2.4 微波功率對精油得率的影響 準確稱取50 g金盞花粉于蒸餾燒瓶中，按照1:30 g/mL料液比與水混合再加3%質量濃度NaCl，在一定功率下微波輻射6 min后蒸餾提取4 h，后續操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在80、240、400、640、800 W微波功率條件下產量的變化。

1.2.2.5 微波時間對精油得率的影響 準確稱取50 g金盞花粉于蒸餾燒瓶中，按照1:30 g/mL料液比加入水以及3%質量濃度NaCl，經過功率為240 W的微波輻射一定時間后蒸餾提取4 h，后續操作如1.2.1所述，觀察了金盞花精油在2、4、6、8、10 min微波時間條件下產量的變化。

1.2.3 正交試驗 參照單因素實驗的結果，以金盞花精油得率為指標，選取三個得率波動較大的因素（NaCl濃度、料液比、微波功率）進行三因素三水平正交試驗，其他兩項因素水平固定在提取時間4 h，微波時間8 min。試驗設計水平安排如表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 金盞花精油得率的計算

1.2.5 GC-MS分析金盞花精油成分

1.2.5.1 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流量：1 mL/min，進樣量：1 μL；分流比：30:1。

1.2.5.2 質譜條件 電離方式EI，電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲：4 min;掃描離子質量范圍：35～550 amu。對照質譜庫NIST08結合參考文獻進行成分定性，使用面積歸一化法計算金盞花精油各組分的相對含量。

1.2.6 金盞花精油對DPPH自由基清除能力測定 參考蘇瑾等[10]的方法：將1 mL精油-無水乙醇稀釋液用移液槍轉移到5 mL離心管中，再移取1 mmol/L的DPPH反應液3 mL，渦旋后在陰暗條件下反應30 min，測得混合液在517 nm下的吸光值A1，無水乙醇代替精油測得A0，無水乙醇代替DPPH反應液測得A2，用無水乙醇作調零，以抗壞血酸作為陽性對照，平行操作重復3次。清除率按下式計算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：無水乙醇代替DPPH反應液所得吸光值。

1.2.7 金盞花精油對羥自由基清除能力測定 參考范三紅等[11]和刑穎等[12]的方法：首先用移液槍移取6 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液各1 mL加入到5 mL離心管中，再移取1 mL精油-無水乙醇稀釋液，最后加入1 ml 6 mmol/L H2O2于37 ℃水浴30 min，在510 nm下測定吸光度值A1，蒸餾水代替精油測得A0，蒸餾水代替H2O2測得A2，用無水乙醇調零，以抗壞血酸作為陽性對照，平行操作重復3次。清除率按下式計算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：蒸餾水代替H2O2所得吸光值。

1.2.8 ABTS+自由基清除能力測定 參考李娜等[13]的方法：分別用10 mL容量瓶以蒸餾水為溶劑配制好7 mmol/L ABTS溶液與2.5 mmol/L過硫酸鉀溶液后在燒杯中混合，避光保存16 h后即為ABTS儲備液，然后用無水乙醇將其稀釋成734 nm下OD值為0.70±0.02的淡綠色的ABTS工作液。將1 mL精油?無水乙醇稀釋液與2 mL上述工作液在5 mL離心管中混合后于陰暗條件下反應30 min，在734 nm處測定吸光值A1，無水乙醇代替精油測得A0，無水乙醇代替ABTS工作液測得A2，用無水乙醇調零，以抗壞血酸為陽性對照，平行操作重復3次。清除率按下式計算：

式中：R：清除率，%；A0：空白組吸光值；A1：樣品組吸光值；A2：無水乙醇代替ABTS工作液所得吸光值。

1.3 數據處理

利用Excel（版本：2010；微軟公司，美國）和SPSS（版本：25.0；IBM公司，美國）進行數據處理和分析，方差分析（ANOVA）采用鄧肯多重比較（α=0.05），使用Origin（版本：2018；IBM公司，美國）對實驗數據進行作圖。所有測定重復三次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對精油得率的影響 不同提取時間對金盞花精油得率的影響如圖1所示，可以看出金盞花精油的得率呈現先升高后降低的趨勢，在2～4 h時間里精油隨著時間的延長不斷積累，所以得率呈現上升趨勢，反應4 h可得最高得率（0.13%）；當反應超過4 h后，金盞花精油不再延續積累的態勢，出現略微下降的趨勢，這可能是因為金盞花精油長時間在較高的溫度下會揮發而造成損失[14]，因此最佳提取時間為4 h。

圖1 提取時間對金盞花精油得率的影響Fig.1 Effect of extract time on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.2 NaCl濃度對精油得率的影響 不同NaCl添加量對金盞花精油得率的影響如圖2所示，可以看出金盞花精油的收率一開始會隨著NaCl添加量的升高而提高，在NaCl濃度升高至為3%時折線圖達到頂點，這是因為NaCl作為一種無機鹽夾帶劑可以使體系中精油溶解度降低，同時一定量的NaCl可以讓組織與溶液形成較大的滲透壓差，迫使精油溶出而被提取出來[15]。另外經過NaCl溶液的浸泡可以利用其鹽析作用使精油更透亮美觀。隨后繼續提高NaCl濃度，精油的收率出現急劇下降的態勢，這可能是根據拉烏爾定律，高濃度的NaCl使體系飽和蒸氣壓降低，難以達到大氣壓強，導致精油更難蒸出[16]。因此最佳NaCl濃度為3%。

圖2 NaCl濃度對金盞花精油得率的影響Fig.2 Effect of NaCl content on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.3 料液比對精油得率的影響 不同料液比對金盞花精油的得率影響如圖3所示，可以看出，隨著料液比的增加，金盞花精油的得率提高，但當原料與加水量的比例超過1:30 g/mL后，得率便會出現斷崖式下跌。這是因為當加水量較少時，原料與水接觸并不完全，浸潤度不高，精油不能完全釋放從而限制得率。加水量提高之后，有更充足的溶液與原料接觸，精油可以更多地隨蒸氣蒸發出來。但如果加水量過高的話，則會使得精油更多地溶解分散在水中，同時液量的增加亦會減弱微波熱效應，最終導致得率嚴重降低[17?18]。因此最佳料液比為1:30 g/mL。

圖3 料液比對金盞花精油得率的影響Fig.3 Effect of material to liquid on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.4 微波功率對精油得率的影響 不同微波功率對金盞花精油得率的影響如圖4所示，可以看出，隨著微波功率的提高，收率呈現先增加后降低的現象，在240與400 W收率相差不明顯，但240 W提取效果略好于400 W。當微波功率逐漸增加時，料液的溫度也會隨之升高，加劇了分子熱運動，使細胞內的物質更容易滲出，從而提高了金盞花精油得率。但隨著功率的持續增大，精油成分中熱敏性物質會因過高的加熱溫度而受破壞和損失，從而降低了金盞花精油的得率[19]。因此最佳微波功率為240 W。

圖4 微波功率對金盞花精油得率的影響Fig.4 Effect of microwave power on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.1.5 微波時間對精油得率的影響 不同微波時間對金盞花精油得率的影響如圖5所示，整體來看，金盞花精油在2～10 min內得率的變化浮動相比其他因素較小，最高與最低相差只有0.02%左右。精油產量隨著微波時間的延長而提高，微波輻射8 min產出效果最好，若再延長在微波反應器中的反應時間，會使產量下降。這可能是由于短時間的微波輻射所產生的熱效應較小，對于植物細胞的腺體和細胞的破壞不完全，有效成分溶出較少；而微波加熱時間過長會出現熱敏成分揮發或降解的現象[20?21]。因此最佳微波時間為8 min。

圖5 微波時間對金盞花精油得率的影響Fig.5 Effect of microwave time on the yield of essential oil from Calendula officinalis L.

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。從表2極差分析中可以得出影響金盞花精油產量的主次順序為A>C>B，即NaCl濃度大于微波功率大于料液比。由表3可知，NaCl濃度對金盞花精油得率影響極顯著（P<0.01），微波功率對得率的影響顯著（P<0.05），料液比對于得率的影響未表現出顯著性，這說明方差分析與極差分析結果一致。根據結果得出，金盞花精油的最佳提取工藝為A2B2C2，即NaCl濃度3%，料液比1:30 g/mL，微波功率240 W。由于最優組合在正交結果中不存在，所以在經過三次驗證試驗后，在此條件下金盞花精油產量為0.156%±0.002%，該結果比正交表中的結果都要高，理論與實際相吻合，由此可見通過正交試驗優化得到的最優工藝參數呈現較好重復性及可靠性。相比于以往文獻[22]中金盞花精油得率（0.02%～0.06%）有了極大提高。

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance results of orthogonal test

2.3 GC-MS結果分析

金盞花精油的GC-MS結果如圖6和表4所示，總計分離出25種組分，占被檢總量的97.74%，其中有11種醇類化合物，占總成分的67.42%；6種萜烯類化合物，占總成分的22.53%；3種萜烯類氧化物，占總成分的3.75%；2種酮類化合物，占總成分的2.24%；2種烷烴化合物，占總成分的1.31%；1種酯類化合物，占總成分的0.49%。

表4 金盞花精油成分的GC-MS分析結果Table 4 GC-MS analysis of essential oil from Calendula officinalis L.

圖6 金盞花精油的總離子流色譜圖Fig.6 Total ion flow chromatography of essential oil from Calendula officinalis L.

通過采用面積歸一化法計算金盞花精油各組分相對含量可以看出，在已鑒定的揮發性成分中含量超過1%的成分共有15個，占據主導的是α-杜松醇（37.27%），是一種倍半萜醇類化合物，具有很強的殺螨活性[23]，這與黃妙玲等[24]和Petrovic等[25]的分析結果相似；其次是β-杜松烯（13.59%），是一種倍半萜烯，具有百里香和木材的香氣[26]，然后是T-依蘭油醇（13.08%）、愈創醇（6.22%）、γ-杜松烯（3.34%）、喇叭烯（2.15%）等，這些主要成分占總成分的90.67%。Khalid等[27]研究了不同培養狀態下金盞花精油的成分組成，發現其主要成分為α-杜松醇（32.01%～65.99%）、δ-杜松烯（17.79%～23.14%）、α-桉葉醇（0.26%～9.77%）。Okoh等[28]分析了金盞花干葉、鮮葉、鮮花中精油的化學成分，發現在這三個部位中都具有較高的α-側柏烯（17.8%～26.9%）、T-依蘭油烯（13.1%～40.9%）以及δ-杜松烯（9.0%～13.1%），除此之外，在鮮花精油中還有較多的大牛兒烯（2.8%）、α-可巴烯（2.7%）等[28]，但這些物質在本試驗中并未檢出，可能是由于金盞花品種及產地、處理條件和提取方式的不同，導致得到的精油成分種類及含量具有一定差異性，但大部分檢出組分與前人報道保持一致。

2.4 金盞花精油抗氧化活性分析

2.4.1 金盞花精油對DPPH自由基的清除作用 金盞花精油抵御DPPH自由基氧化的原理是精油所含的有效組分提供單電子將DPPH所帶的電子捕獲從而使其紫色減褪，紫色消褪越明顯其抗氧化性越強[29?30]。由圖7可以看出，在5～35 mg/mL濃度范圍內，隨著濃度的增大，精油對DPPH自由基的清除率逐漸增高，濃度為35 mg/mL時清除率達到55.71%，且有繼續增長的趨勢，IC50為28.89 mg/mL，但相比于VC來說，金盞花精油抵御DPPH自由基的氧化能力較弱。Sahingil[1]研究了金盞花精油的DPPH抗氧化性，在精油用量為200 μg/mL的條件下，DPPH自由基清除率為72.48%，相較于本試驗對于DPPH的抗氧化性更強，可能是因為其所制備的金盞花精油里具備本次試驗未能檢出的γ-萜品烯和檸檬烯，這兩種成分都具有可觀的DPPH自由基清除活性[10,31]。

圖7 金盞花精油對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on DPPH free radical

2.4.2 金盞花精油對羥自由基的清除作用 由圖8可知，在5～35 mg/mL濃度范圍內，金盞花精油對羥自由基的清除能力呈現較好的量效關系，隨著濃度的增大，精油對羥自由基的清除率逐漸增高，濃度為5 mg/mL時清除率為44.92%，濃度為35 mg/mL時清除率達到92.18%，且仍有增長的趨勢，此時已接近同濃度VC的清除活性，金盞花精油清除羥自由基的IC50為6.77 mg/mL。研究表明精油中的α-松油醇具有很好的羥自由基清除效果[32]，因此金盞花精油較強的羥自由基清除能力可能與其含一定的α-松油醇有關。

圖8 金盞花精油對羥自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on hydroxyl free radical

2.4.3 金盞花精油對ABTS+自由基的清除作用 ABTS+·在734 nm下具有最大吸收波長，可通過過硫酸鉀與ABTS反應獲得，在與抗氧化成分反應后可使其藍綠色減褪，褪色程度與抗氧化能力呈正相關[33]。由圖9可知，VC在5～35 mg/mL濃度范圍內均處于99%以上。在2～14 mg/mL濃度范圍內，金盞花精油對ABTS+自由基的清除能力呈現較好的量效關系，隨著濃度的增大，精油對ABTS+自由基的清除率逐漸增高，濃度為2 mg/mL時清除率為43.79%，濃度為14 mg/mL時清除率達到98.40%，且有繼續增長的趨勢，此時已接近同濃度VC的清除活性。金盞花精油清除ABTS+自由基的IC50為2.21 mg/mL，表明金盞花精油具有良好的ABTS+自由基清除能力，而且其相關的成分主要是β-桉葉醇和α-松油醇[34]。

圖9 金盞花精油對ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of essential oil from Calendula officinalis L. on ABTS+ free radical

3 結論

本研究采取微波輔助法提取的金盞花精油外觀呈金黃色澄清液體，散發濃郁金盞花香氣，通過單因素實驗和正交試驗確定了金盞花精油的最優提取工藝為NaCl濃度3%，料液比1:30 g/mL，微波功率240 W，此參數下金盞花精油收率為0.156%±0.002%，較先前文獻極大提高了金盞花精油的產量。由GC-MS結果可知從金盞花精油中分離出25種化學組分，最為主要的是α-杜松醇（37.27%）、β-杜松烯（13.59%）和T-依蘭油醇（13.08%）。從抗氧化試驗中可以看出金盞花精油對三種自由基都呈現一定清除能力，三者相比來說對于ABTS+自由基清除能力最好，對于DPPH自由基清除能力較弱。綜上所述，金盞花精油是一種有潛力的天然抗氧產物，在天然抗氧化劑和抗衰老的化妝品、藥物中有著極大的應用價值與潛力，接下來還需要進一步研究的是其抗氧化效果與相應成分的關系以及具體的抗氧化機理。