泉州市平菇木霉病菌的分離及鑒定

藍波妙

（泉州市農業科學研究所 福建泉州 362212）

平菇（Pleurotus ostreatus）屬于側耳科（Pleurotaceae）側耳屬（Pleurotus）[1]，可人工栽培，多見于溫帶至亞熱帶地區。平菇營養價值高，含有多種氨基酸、維生素、礦物質及碳水化合物，除食用價值外，還具有很好的藥理作用，可以降血脂，保肝解毒，其含有的菌類多糖能夠消滅腫瘤細胞[2]。在平菇栽培過程中，常發生病害，引起平菇發生病害的微生物主要包括真菌、細菌、病毒等，其中木霉是平菇生產過程中較常見且危害較大的真菌之一[3-5]。木霉（Trichoderma）是無性型真菌，屬于半知菌類的絲孢菌綱（Hyphomycetes），肉座菌科（Hypocreaceae）的肉座菌屬（Hypocrea Fr）。1996年Rifai首次對木霉屬進行系統分類，將木霉屬分為9個復合種，分別是綠色木霉（T.viride）、康氏木霉（T.koningii）、黃綠木霉（T.aureovirid）、哈茨木霉（T.harzianum）、長枝木霉（T.longibrachiatum）、擬康氏木霉（T.pseudokoningii）、鉤狀木霉（T.hamatum）、多孢木霉（T.polysporum）和小球木霉（T.piluliferm）。Bissett根據木霉菌的性狀特征并結合前人的研究結果，提出了一個新的分類系統，引進了組（section）的概念，將木霉屬重新劃分成了 5個組：長枝組（Longibraehiatum）、土星孢組（Satumisporum）、木霉組（Trichoderma）、厚基組（Paehybasium）和肉座組（Hypocreaum）。我國對木霉屬真菌的分類研究，大多集中在對木霉應用的開發上。1993年，文成敬等[6]從西南地區的土壤中分離鑒定出9個木霉種，分別是哈茨木霉（T.harzianum）、擬康氏木霉（T.pseudokoningii）、長枝木霉（T.longibrachiatum）、深綠木霉（T.atroviride），桔綠木霉（T.citrinoviride）、綠色木霉（T.viride）、鉤狀木霉（T.hamatum）、康氏木霉（T.koningii）及黃綠木霉（T.aureovirid）。2005年，章初龍等[7]從河北、浙江及云南等地分離到了8個已知種的木霉菌，4個新紀錄木霉種，包括棘孢木霉（T.asperllum）、淡黃木霉（T.cerinum）、螺旋木霉（T.spirale）、茸狀木霉（T.veletinum）。2006年，孫軍等[8]從遼寧省的土樣和植物組織中分離鑒定出了 12種木霉，其中 11種為已知種，長孢木霉（T.longipilis）為中國新紀錄種。據報道，危害香菇、平菇等食用菌的木霉種類主要有哈茨木霉、康氏木霉、綠色木霉和長枝木霉[9-14]等。

目前對食用菌木霉病害的鑒定主要是采用形態學和分子生物學相結合的方法。形態學觀察包括菌落形態、生長速率、有無揮發性氣體產生等；木霉分子生物學鑒定主要是根據真菌核酸序列的rDNA在18S和28S區域具有保守性，在ITS區段又存在著水平上的差異，通過對ITS區進行擴增測序來檢測真菌。Kim等[15]運用形態學和 ITS結合的方法在培養香菇的椴木上鑒定出一種新木霉T.mienum。張廣志等[16]利用形態學和ITS序列比對分析相結合的方法從阿魏菇腐爛菌蓋上分離出一株側耳木霉。程麗云等[17]利用形態學和分子生物學相結合的方法從福建的食用菌及土壤中分離得到125株木霉，鑒定出5個種。2010年李廣記等[18]通過ITS序列和形態學分類方法對華東地區采集到的木霉菌株進行鑒定，得到一株擬康氏木霉（T.koningiopsis）。

近年來，泉州市食用菌產業規模不斷發展壯大，平菇逐漸形成規?；a，但平菇病害發生嚴重，影響平菇產業的發展，給菇農造成較大損失。其中，木霉病發病速度快，可造成嚴重減產或使平菇失去商業價值。木霉種類多，不同地區木霉的優勢種類不同，不能進行有效的針對性的治理。關于泉州市平菇木霉菌的主要種類尚未見報道，筆者將傳統的形態學和現代分子生物學手段相結合，對平菇木霉菌進行菌種鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

PDA固體培養基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，pH 6.8~7.0，121℃滅菌30 min；PDA液體培養基：PDA固體培養基中不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 平菇病害樣品采集2020年分別于泉州市惠安縣和豐澤區等地的平菇工廠觀察病害癥狀，隨機采集樣品，進行分離實驗。

1.2.2 病原菌的分離純化打開超凈工作臺紫外滅菌20 min，關閉紫外后通風5 min；點燃酒精燈，燒熱接種環，待涼后用接種環刮取發病部位霉層，采用平板劃線的方法進行分離，在培養皿上做好標記，貼好封口膜，放置于28℃的恒溫箱中培養；48 h后等菌絲長出后再進行純化，如此重復純化3~4次后，將得到的病原菌株轉接于PDA斜面上，待菌落較為豐滿或有大量孢子產生時放于 4℃冰箱保存[19]。

1.2.3 形態特征觀察及性狀測定將分離到的菌株接種到 PDA固體培養基平板上，于 28℃培養48 h后，觀察菌落形態，顏色反應，菌體大小。

1.2.4 16 S rDNA分子鑒定

1.2.4 .1 基因組 DNA 提取將分離出來的致病菌接種于PDA液體培養基上，放置于120 r/min的搖床上培養過夜，取培養好的菌液以100 000 g室溫下離心 30 s，收集沉淀的菌體，按照生工SK1201-UNIQ-10柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）說明書提取基因組DNA。

1.2.4 .2 PCR擴增及產物測序引物序列：7F（5′CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′），1540R（1522）（5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′），由上海生工生物工程有限公司提供。

PCR反應體系（50 μL）：1 μL基因組 DNA（10 pmol），引物各 1 μL（10 μmol/L），1 μL dNTPs（10 mmol/L），5 μL 10×PCRbuffer，0.25 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），加水至 50 μL。

PCR反應條件：98℃預變性5 min；95℃變性35 s，55℃退火35 s，72℃延伸90 s，35個循環，72℃終延伸8 min。

PCR產物委托上海生工生物技術公司進行純化和序列測定。將測序結果與NCBI GenBank數據庫進行blast比對，得出單克隆菌株所屬分類地位。選取每個單克隆菌株的近緣序列，利用MEGA5.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 泉州市平菇病害發生情況

2020年4月至2020年10月對泉州市惠安、豐澤等地的菇廠進行病害調查，發現競爭性真菌病害普遍發生，危害嚴重。通過本次調查可知，泉州市平菇真菌性病害主要表現為平菇菌袋或培養料受到病原菌的污染，平菇菌絲不能正常生長（圖1）。

圖1 平菇病害癥狀

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的形態鑒定經菌落形態觀察，本次分離到3種真菌。其主要形態特征如下：

菌株P1在PDA平板上，菌落生長迅速，致密棉絮狀。菌落起初為白色，培養時間延長 3 d后菌落顏色逐漸變為淺綠色，反面為無色（圖2）。菌株P1形態特征與John Bisset[20]和張廣志等[21]描述的里氏木霉一致，故將菌株P1初步鑒定為里氏木霉（Trichoderma reesei）。

圖2 菌株P1（里氏木霉）

菌株P2在PDA平板上，菌落迅速生長，培養 2~3 d后，可產生簇狀白色氣生菌絲；菌落剛開始培養時表現為白色，后轉變為淡綠色，培養3 d后表現為墨綠色，在產孢簇邊緣形成白色流蘇狀菌絲（圖3）。菌株 P2的形態特征與 John Bissett[22]及張廣志等[21]對側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的描述一致，因此初步將菌株P2鑒定為側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）。

圖3 菌株P2（側耳木霉）

菌株P3在PDA平板上生長迅速，菌絲初期呈白色毛氈狀，3 d后產孢并變為淺綠色；菌落老熟時為茶綠色，背面由白色變為黃色（圖4）。菌株P3與Bissett[23]描述的長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形態結構一致，故將菌株 P3初步鑒定為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

圖4 菌株P3（長枝木霉）

2.2.2 木霉菌序列比對與系統發育分析將分離純化后的菌株P1、P2、P3提取基因組DNA后，利用PCR對其ITS片段進行擴增，測序得到3條不同的堿基序列；將3條序列在NCBI數據庫中進行Blast序列檢索（表1）；各選取2個相似度較高的序列，構建系統發育樹（圖5）。根據Bissett系統的分組情況，并結合進化樹可以看出，P1菌株的序列與里氏木霉（Trichoderma reesei）的遺傳距離最近，P2菌株與側耳木霉（Trichoderma pleuroticola）的遺傳距離最近，P3菌株與長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的遺傳距離最近，都各自聚在一個小分枝里；因此，結合其形態特征和ITS序列系統發育分析結果，將菌株P1鑒定為里氏木霉（Trichoderma reesei），菌株 P2鑒定為側耳木霉（Trichoderma pleuroticola），菌株 P3鑒定為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。菌株P1所處的這個分枝與P3的分枝聚在一起，共同屬于長枝組（set.longibachiatum），P2菌株所在的小分枝則屬于厚基孢組（set.pachybasium）。

表1 平菇木霉病菌16S rDNA序列的Blast比對結果

圖5 三株木霉ITS系統進化樹

3 討論

平菇為木腐生營養型的食用菌，主要以多種含有纖維素、半纖維素以及木質素成分的玉米芯、稻草等為培養料。絕大多數的木霉是纖維素酶的生產菌株，因此，木霉成為食用菌生產中主要的栽培料污染菌；同時，食用菌的栽培料也有適于木霉的生長。泉州夏天高溫時間較長，平菇病蟲危害嚴重，有的菇廠木霉污染率高達90%以上，菇農損失慘重。為了分離與鑒定危害平菇的病菌，明確危害菌的種類，筆者利用純培養特征和分子鑒定相結合的手段，初步確定了泉州地區平菇栽培過程中污染菌的種類，主要有里氏木霉、長枝木霉和側耳木霉，為有針對性地進行病害防治奠定了基礎。由于真菌核酸序列的rDNA在18S和28S區域具有保守性，通過對 ITS區進行擴增測序來檢測病原真菌的技術已被廣泛應用。

研究鑒定木霉菌屬對病害的發生和防治有著重要的作用。泉州屬于亞熱帶季風氣候，冬天主要受蒙古冷高壓控制，盛行偏北風，氣溫低，干燥少雨；夏季受副熱帶高壓影響，盛行偏南風，氣溫高，濕潤多雨。泉州夏季高溫高濕的天氣，有利于木霉病害大面積迅速爆發。因此，確定了木霉病菌的種類，在食用菌病害防治方面更有針對性，并可根據天氣合理安排栽培時間，避開病害高發期，或選擇抗病品種，加強管理。

隨著木霉在工農業生產上的應用越來越多，木霉分類學的研究也越深入[24-25]。本研究旨在明確平菇生產中污染菌木霉的種群結構，從而為木霉病害的安全防治提供理論依據。