基于網絡藥理學和分子對接探討補陽還五湯治療糖尿病腦病的作用機制

李劍 張文風

摘要 目的：基于網絡藥理學方法和分子對接技術，探討補陽還五湯有效成分治療糖尿病腦病潛在作用機制。方法：從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）和中科院化學專業數據庫篩選出補陽還五湯有效化學成分及其靶點，通過GeneCards、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數據庫收集糖尿病腦病靶點，運用STRING數據庫構建蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡圖并通過Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件篩選關鍵靶點。利用ClusterProfiler程序包進行基因本體（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，并通過Cytoscape 3.8.0軟件構建補陽還五湯藥物-成分-靶點-通路網絡，最后利用AutoDock軟件進行分子對接驗證。結果：篩選得到補陽還五湯中活性成分108種，對應潛在靶點469個，網絡圖顯示槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌等是補陽還五湯治療糖尿病腦病的關鍵成分，蛋白激酶、P53蛋白、腫瘤壞死因子等是該方治療糖尿病腦病的關鍵靶點。GO富集分析顯示該方可能通過對氧化應激的反應、對藥物的反應、對金屬離子的反應等生物過程發揮作用，與膜筏、膜微域、膜區域等細胞組分有關，與酰胺結合、DNA結合轉錄因子結合、肽結合等分子功能有關。KEGG富集分析顯示主要與PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路有關。分子對接結果表明補陽還五湯中主要活性成分與核心作用靶點具有較為穩定的結合活性。結論：本研究初步揭示了補陽還五湯多成分、多靶點、多通路治療糖尿病腦病的機制，為補陽還五湯的臨床開發利用提供了依據。

關鍵詞 補陽還五湯;糖尿病腦病;網絡藥理學;分子對接;作用機制

Study on the Mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the Treatment of Diabetic Encephalopathy based on Network Pharmacology and Molecular Docking

LI Jian，ZHANG Wenfeng

（College of Basic Medicine，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Abstract Objective：To explore the possible mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of diabetic encephalopathy（DE） based on network pharmacology and molecular docking.Methods：The active components and targets of Buyang Huanwu Decoction were selected from the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） and Chemistry Database of Chinese Academy of Sciences（CAS）.The DE targets were collected from the GeneCards and Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）.STRING was used to construct the protein-protein interaction（PPI） network，and the plugin CytoNCA of Cytoscape 3.8.0 was employed to screen the key targets.The Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis were conducted by Clusterprofiler.The drug-component-target-pathway network was constructed by Cytoscape 3.8.0，and AutoDock was adopted for molecular docking.Results：A total of 108 active components of Buyang Huanwu Decoction were obtained，corresponding to 469 potential targets.The drug-component-target-pathway network showed that quercetin，glycine and senkyunone were the key components of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and protein kinase，P53 protein，and tumor necrosis factors were the key targets.GO enrichment analysis revealed that this prescription may exert the effect through processes such as acting on oxidative stress，drugs，and metal ions，involving the cell components of membrane raft，membrane microdomain and membrane region and the molecular functions of amide binding，DNA-transcription factor binding and peptide binding.KEGG enrichment analysis showed that PI3K-Akt and MAPK signaling pathways were mainly involved.Molecular docking indicated that the main active components in Buyang Huanwu Decoction had stable binding activity to the core action targets.Conclusion：This study revealed the mechanism of Buyang Huanwu Decoction in the treatment of DE，and provided a basis for the clinical development and utilization of the prescription.

Keywords Buyang Huanwu Decoction; Diabetic encephalopathy; Network pharmacology; Molecular docking; Mechanism

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.05.010

糖尿病腦?。―iabetic Encephalopathy，DE）是一種以大腦認知功能減弱為主要癥狀的糖尿病并發癥[1]。根據其臨床表現，可類屬中醫“消渴”并發“健忘”“癡呆”的范疇。消渴日久，內熱熾盛，傷津耗氣，氣虛則推動血液運行無力，血液運行不暢，瘀血阻滯腦絡，遂發為腦病。王永炎院士認為“毒損腦絡”是DE的關鍵病機，解毒通絡為基本法則[2]。經典名方補陽還五湯出自清代醫家王清任的《醫林改錯》，原主治氣虛血瘀之中風，具有補氣活血通絡的作用，為益氣活血的代表方劑?；A研究顯示該方所包含的活血化瘀中藥可通過抑制海馬神經元鈣離子升高和凋亡，抑制膠質細胞的活化，改善血液流變學和微循環障礙，減輕氧化應激和炎癥反應等機制，改善認知功能[3-8]。

因此，本研究采用網絡藥理學方法聯合分子對接技術研究補陽還五湯治療DE的潛在分子機制，以期為補陽還五湯的后續研究提供理論依據。

資料與方法

1. 補陽還五湯有效成分的收集與篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）收集補陽還五湯中7味藥物的化學成分，其中并未檢索到地龍有效成分，故通過中科院化學專業數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn）進行補充檢索，并按文獻報道設定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性值（Drug Likeness，DL）≥0.18，篩選符合條件的有效成分[9-10]。

1.2 補陽還五湯藥材-有效成分-靶點網絡的構建

通過TCMSP獲取黃芪、桃仁、紅花、赤芍、川芎、當歸6味藥有效成分所對應的靶點信息，同時利用中科院化學專業數據庫補充檢索地龍有效成分，并通過PubChem數據庫獲取地龍有效成分的SMILE號，采用SwissTargetPrediction數據庫獲取其靶點。將所有靶點合并、去重，并通過UniProt數據庫對其名稱標準化，然后利用Cytoscape 3.8.0軟件，構建可視化網絡。

1.3 疾病靶點的獲取

利用在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、GeneCards數據庫以“Diabetic Encephalopathy”為關鍵詞搜索與糖尿病腦病相關發病機制靶點，2個數據庫得到的靶點合并，并去掉重復的靶點，得到糖尿病腦病靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建

利用Venny 2.1.0繪制補陽還五湯與DE交集靶點韋恩圖，將其導入STRING數據庫中建立蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡，并利用Cytoscape 3.8.0軟件中CytoNCA插件篩選關鍵靶點。

1.5 基因本體功能與京都基因和基因組百科全書通路富集分析

采用計算機R語言中clusterProfiler程序包對交集靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，并繪制氣泡圖進行可視化。GO包括生物過程，分子功能和細胞組分3個方面[11]。

1.6 分子對接驗證

在PubChem中得到補陽還五湯中化合物的2D結構，并導入Chem3D軟件得到優化后的3D結構;從PDB數據庫中篩選得到的關鍵靶蛋白的3D結構“.pdb”格式文件，通過PYMOL軟件去除了水分子和配體，分離蛋白結構。采用AutoDock軟件并運用Grid模塊設置蛋白原配體為對接盒子中心，其格點盒子大小設定為40×40×40，并對配體小分子可能發生作用的區域進行設定，利用AutoDock Vina分子模擬軟件對藥物小分子和靶蛋白受體進行分子對接分析。結合能小于-5.0 kcal/mol（ kcal=4 186 J）是分子對接時配體和受體穩定結合的標準，結合能越低分子結構穩定性越高[12]。

2 結果

2. 補陽還五湯有效成分及相關靶點的篩選

檢索化合物數據及對應的靶點，其中赤芍29個、川芎7個、當歸2個、紅花22個、黃芪20個、桃仁23個，由于。地龍主要化合物均不滿足OB≥30%和DL≥0.18的條件，故在此未列出地龍的相關數據。將所得化合物去重后共得到108個化合物。將所得靶點去重后共得到469個靶點。補陽還五湯主要化合物及其相關信息見表1。

2.2 構建補陽還五湯藥材-有效成分-靶點網絡

該網絡圖中共包括7個藥材節點、84個有效成分節點和469個靶蛋白節點，共560個節點。見圖1。

2.3 補陽還五湯靶點與DE靶點交集分析

合并去重得到DE靶點2 631個，將藥材與疾病靶點映射后，共得到靶點245個。見圖2。

2.4 構建交集靶點PPI網絡

導入STRING數據庫構建PPI網絡圖。見圖3。通過Cytoscape 3.8.0插件CytoNCA對共有靶點進行拓撲分析，根據degree值大小篩選前20位關鍵靶點進行網絡構建，得到關鍵靶點PPI網絡圖。見圖4。根據網絡間連線節點數目排列，得到PPI網絡中核心靶點條形圖。見圖5。

2.5 GO富集分析 利用ClusterProfiler程序包進行GO功能富集分析，根據基因富集數目與顯著程度，篩選各排名前10，通過R語言包繪制氣泡圖進行可視化處理。見圖6。

其中生物過程主要涉及對金屬離子的反應、對藥物的反應、對氧化應激的回應、細胞對化學應激的反應、對營養水平的反應、對脂多糖的回應、對細菌起源的分子的反應、細胞對氧化應激的反應、老化、對活性氧類的回應等;細胞組分主要涉及膜筏、膜微區、膜區、囊泡腔、胞質囊腔、突觸后膜、蛋白激酶復合物、質膜筏、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、細胞周期蛋白依賴蛋白激酶全酶復合物等;分子功能主要涉及酰胺結合、DNA結合轉錄因子結合、肽結合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子的結合、泛素樣蛋白連接酶結合、羧酸結合、有機酸結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合、氨基酸結合等。

2.6 KEGG富集分析

利用clusterProfiler程序包進行KEGG富集分析，篩選排名靠前的30條通路，通過R語言包繪制氣泡圖進行可視化處理。通路富集分析結果顯示主要涉及PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路、癌癥中的蛋白質、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、人T細胞白血病病毒1感染、前列腺癌、丙型肝炎、肝細胞癌、EB病毒感染、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、細胞衰老、細胞凋亡、甲型流感、HIF-1信號通路、乳腺癌、胰腺癌、內分泌抵抗等。見圖7。

2.7 藥物-成分-靶點-通路的網絡分析

該網絡圖中包括7個藥材節點、84個有效成分節點、469個靶蛋白節點和20條通路節點，共580個節點。見圖8。由網絡圖分析結果知，有效成分中連接邊數較多的為槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素;潛在靶點中AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3連接較多邊數;通路中如PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路與潛在靶點有較多的連接。

2.8 分子對接結果

將藥材成分中度值排名前5的槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素與度值排名前5的潛在靶點AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3進行分子對接分析。見表2，圖9。對接結果顯示活性成分與受體蛋白的最低結合能結果大部分小于-5.0 kcal/mol，說明活性成分與受體蛋白具有較好的結合活性，其中木犀草素和AKT1、TP53最低結合能最小，穩定性最高。分子對接模式見圖10。

3 討論

目前糖尿病腦病的發病機制較為復雜，尚未完全明確，本文基于網絡藥理學聯合分子對接方法，構建了藥材-有效成分-靶點網絡、靶點蛋白PPI網絡、藥材-成分-靶點-通路網絡，對補陽還五湯治療糖尿病腦病的分子機制進行預測分析，為補陽還五湯的后續深入研究提供科學依據。

槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分度值較高，在治療過程中可能發揮重要作用。其中槲皮素能夠提高高糖培養海馬神經元活性，抑制海馬神經元凋亡，其作用機制可能與內質網應激有關[13]。山柰酚可能是通過降低血糖，維持正常血脂水平，抗氧化、抗炎、降低醛糖酶途徑，從而對2型糖尿病大鼠的心腦血管等慢性并發癥產生保護作用[14]。木犀草素可以抑制海馬神經細胞凋亡糖尿病腦病大鼠體內的細胞，其作用機制包括間接的抗氧化作用和抑制凋亡相關因子。另外，木犀草素激活磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT信號轉導途徑，并因此抑制海馬神經細胞的凋亡[15]。

PPI網絡拓撲學分析顯示，AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等為補陽還五湯治療DE的潛在作用關鍵靶點。其中AKT1又稱蛋白激酶B，對海馬神經元細胞的生長及生存起重要的調控作用[16]。有證據表明，AKT1蛋白可能與2型糖尿病患者認知功能減退有關[17]。大腦AKT1磷酸化是胰島素和其他生長因子信號轉導中的關鍵節點[18]。TP53是一種抑癌基因，可參與葡萄糖等多種代謝途徑[19]。醛糖還原酶通過激活TP53導致糖尿病介導的線粒體功能障礙和損傷[20]。腫瘤壞死因子（TNF）可促進細胞增殖和分化，并參與某些自身免疫病的病理損傷[21]。有研究表明，糖尿病腦病小鼠腦組織中小膠質細胞活化，TNF明顯升高[22]。血管內皮生長因子A（VEGFA）在血管生成和內皮細胞生長中發揮重要作用，可以誘導內皮細胞增殖、促進細胞遷移、抑制細胞凋亡并誘導血管通透性等[23]。胱天蛋白酶-3（Caspase-3）是能夠特異性切割靶蛋白天冬氨酸殘基上肽鍵的一種蛋白酶，在細胞凋亡過程發揮重要作用[24]。研究發現，海馬區細胞凋亡是糖尿病腦病發病的重要因素[25]。

通路富集分析顯示，補陽還五湯可能通過干預PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路等治療DE。劉昭前等[26]研究表明可通過抑制PI3K-AKT信號通路減輕炎癥反應起到對糖尿病腦病大鼠模型的神經保護作用。Liu等[27]研究表明糖尿病性腦病中小膠質細胞的調節可能涉及MAPK信號通路，小膠質細胞-神經元的相互作用在糖尿病性腦病中起重要作用，而小膠質細胞活化的調節可能是糖尿病性腦病的治療目標。

綜上所述，補陽還五湯可能通過槲皮素、甘氨酸、洋川芎醌、山柰酚、木犀草素等活性成分，作用于AKT1、TP53、TNF、VEGFA、CASP3等靶點，涉及PI3K-AKT信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、乙肝、MAPK信號通路等機制來實現治療DE的目的。本研究表明，補陽還五湯治療DE呈現出多成分、多靶點、多通路的作用優勢，為后續的細胞及動物實驗研究和臨床新藥開發及應用提供思路和參考依據。

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（2021-02-18收稿 本文編輯：魏慶雙）