小麥TaKLU基因調控植物株型的研究

周夢蝶，李夢瑤，吳林楠，郭利建，王 倩,2，馬 猛,2

(1.西北農林科技大學生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.旱區作物逆境分子生物學國家重點實驗室，陜西楊凌712100)

作物株型受株高、分枝數目、分枝角度等因素的影響，是決定作物產量的關鍵因素之一。其中，分枝數目是影響株型的主要因素，一般與株高呈負相關。在表現形式上，作物通常有兩種分枝狀態，分別為分枝少而株高高與分枝多而株高矮，表現為頂端優勢的加強與弱化。因此，作物的分枝數目及株型在很大程度上受到頂端優勢的影響，進而決定作物產量形成。不同作物對頂端優勢的利用存在很大差異。如玉米通過加強頂端優勢、減少分枝來增加產量，而水稻則通過增加分枝數目、弱化頂端優勢來提高產量。因此，改良作物株型是成功培育高產作物新品種的關鍵途徑之一，但調控小麥株型的分子機制尚不明了。

基因家族是一類只存在于植物體內的P450亞家族，對作物的性狀改良育種具有重要的意義。前人對家族基因的研究多集中在單個器官發育上，尤其是對籽粒大小的調控。擬南芥中，5()基因正調控生殖器官大小，過表達該基因會導致花序和種子增大；和雙突變體表現為育性降低和籽粒變小，導致產量降低。水稻中，()基因通過調節胚和胚乳的比例，影響籽粒大小和產量；()基因是擬南芥基因的直系同源基因，通過調節葉原基細胞的增殖影響葉片發育，突變體表現為葉片起始速率加快、葉片變小。玉米中，()基因調控器官大小、株高和產量，并且涉及生長素代謝，暗示基因的調控作用可能不僅僅局限于單個器官，甚至于影響整個植株的發育。目前研究者普遍認為，家族基因以非細胞自主的方式，通過調控下游的促生因子來促進植株發育，即類似于植物激素的作用模式。

本課題組前期研究發現，小麥基因家族包含四個成員，分別為、(以下用表示)、和，其中，和基因對籽粒大小和生殖器官發育具有顯著調控作用。然而植物中關于家族基因調控株型的研究鮮有報道。本研究通過綜合調查小麥對擬南芥分枝數目、頂端優勢的影響，初步明確基因與株型的關系，以期為進一步揭示基因調控植物株型的功能和機制奠定基礎，為小麥株型改良育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用小麥材料為小偃6號，擬南芥材料為哥倫比亞野生型(Columbia-0)。擬南芥功能缺失突變體(Salk_024697C)購自Biological Resource Center(https://abrc.osu.edu/)。

LB：左邊界；35S T PolyA：35S(CaMV35S)終止子；Bar：抗除草劑基因；CaMV35S/35S：花椰菜花葉病毒35S啟動子；pKLU：擬南芥KLU基因啟動子；pINO：擬南芥胚珠特異啟動子；NOS T：NOS基因終止子；RB：右邊界。

1.2 試驗方法

1.2.1 陽性植株的篩選

利用RNA提取試劑盒(百泰克，中國)提取小麥苗期葉片總RNA，并用反轉錄試劑盒(艾科瑞，中國)反轉錄為cDNA。利用特異性引物TaKLU-cDNA-F/R對基因編碼區進行擴增。選用pCAMBIA3301表達載體(含有35S啟動子和Basta除草劑抗性)進行載體構建，通過I和II限制性酶切位點將基因的編碼區序列連接到pCAMBIA3301載體的35S啟動子，獲得35S::過表達載體(圖1A)，并將其導入野生型擬南芥中，獲得3個轉基因擬南芥株系(35S::-1、35S::-3和35S::-5)。利用特異性引物pKLU-F/R擴增擬南芥基因(AT1G13710)上游2 229 bp的啟動子序列，通過R I和I限制性酶切位點將擴增得到的pKLU啟動子序列替換表達載體p35S::中的35S啟動子序列，獲得表達載體pKLU::(圖1B)；利用特異性引物pINO-F/R擴增擬南芥基因 (AT1G23420)啟動子序列，通過R I和I限制性酶切位點將擴增得到的pINO啟動子序列替換35S::中的35S啟動子序列，獲得表達載體pINO::(圖1C)。具體引物序列見表1。上述構建的表達載體分別轉入農桿菌EHA105中，并通過花序侵染法導入擬南芥突變體中進行回補試驗，獲得pKLU::;、pINO::;和35S::;回補轉基因株系，以驗證基因在調控株型和器官發育方面的功能。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primers used in the study

將上述T代轉基因擬南芥株系、野生型以及突變體材料的種子種植在蛭石和營養土的混合 (1∶2)土壤中，在溫室(16 h光照/8 h黑暗)中培養，培養溫度為22 ℃，直至全部角果成熟。

基于陽性轉基因擬南芥能夠獲得除草劑Basta(含20%草銨膦)的抗性，本研究通過對擬南芥葉片(2片真葉時)噴施200 mg·L的Basta溶液對陽性植株進行初步篩選；用CTAB法提取轉基因陽性植株、野生型和突變體的葉片DNA，以野生型和突變體的葉片DNA為對照，進一步利用TaKLU-F/R引物(表1)對Basta篩選的陽性植株進行PCR鑒定；最后綜合Basta篩選和PCR鑒定結果，確定下一步試驗的陽性植株。PCR反應體系為20 μL，包括2×Rapid Tap Master Mix(諾唯贊，中國)10 μL，模板DNA(60 ng·μL)1 μL，上下游引物(10 μmol·μL)各0.5 μL，HO 8 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，68 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，29 個循環；72 ℃ 5 min。

為了進一步檢測回補轉基因擬南芥中的基因是否正常表達，收集轉基因擬南芥和對照植株組織的樣品[其中pINO啟動子驅動基因表達的轉基因植株以及野生型和突變體在生殖生長期(發芽后6周)取花序作為檢測樣品，其他啟動子驅動基因表達的轉基因擬南芥在發芽后3周取葉片作為檢測樣品]，利用RNA提取試劑盒(百泰克，中國)提取上述樣品總RNA，并用反轉錄試劑盒(艾科瑞，中國)反轉錄為cDNA；以TaKLU-RT-F/R為引物，利用qRT-PCR檢測基因的轉錄水平。以cDNA為模板，PCR反應體系同上。PCR反應程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，35個循環。

1.2.2 轉基因擬南芥的形態學觀察

以野生擬南芥為對照，對35S::、pKLU::;、35S::;和pINO::;轉基因株系的分枝數目和頂端優勢進行觀察，并在萌發后10周統計不同株系的總分枝數目，用數碼相機記錄表型，試驗重復3次。

1.2.3 轉基因擬南芥的產量性狀統計

為了測量準確，一個小盆種一株擬南芥。待野生型、35S::轉基因植株和突變體植株開始有角果成熟時，以單株為單位，每隔1 d收集一次成熟且干黃的角果，直至所有角果成熟。最后將所有種子置于37 ℃烘箱中放置一周，完全干燥后用于測定單株產量。

1.3 數據處理

用Excel 2013對數據進行平均值、檢驗和標準誤的分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因擬南芥的陽性鑒定結果

T代轉基因擬南芥的種子在混合營養土中萌發后，經過Basta溶液噴施篩選后，挑選陽性幼苗移栽到小盆中進行下一步的檢測和觀察。待發芽后3周，提取35S::、pINO::;、pKLU::;、35S::;轉基因擬南芥以及野生型和突變體的葉片DNA，并用特異性引物TaKLU-F/R進行進一步的陽性鑒定。結果(圖2A)顯示，具有Basta抗性的轉基因擬南芥均含有外源目的基因。

為更進一步檢測外源目的基因在擬南芥中的表達水平，在發芽后3周收集35S::、pKLU::;和35S::;轉基因擬南芥以及野生型和突變體的葉片，在發芽后6周收集pINO::;轉基因擬南芥以及野生型和突變體的花序，提取樣品的總RNA，并利用qRT-PCR檢測目的基因的表達模式。結果(圖2B和2C)顯示，35S::、pKLU::;、35S::;和pINO::;轉基因擬南芥中均能檢測到外源目的基因的表達，而野生型和突變體中未檢測到基因的表達，各植株中內參基因的表達模式相擬，表明上述轉基因植株均為陽性植株，可用于后續的表型觀察。

A：不同株系中外源目的基因TaKLU的PCR檢測；B：qRT-PCR檢測不同株系葉片中TaKLU的表達；C：qRT-PCR檢測不同株系花序中TaKLU的表達；M：250 bp DNA Ladder Marker；1：野生型擬南芥；2：35S::TaKLU-1；3：35S::TaKLU-3；4：35S::TaKLU-5；5：pKLU::TaKLU;klu；6：35S::TaKLU;klu；7：pINO::TaKLU;klu；8：klu突變體；9：水；Actin：內參基因。

2.2 KLU基因缺失對擬南芥形態的影響

結果(圖3)發現，與野生型擬南芥相比，突變體株高降低，花序和葉片變小，但分枝數目顯著增加，增幅約為70%。此外，突變體主莖與分枝的高度幾乎無明顯差異，表現為頂端優勢的弱化。因此，推測基因能夠調控株型，影響植株的頂端優勢。

A：野生型擬南芥與klu突變體的植株形態比較；1：野生型；2～5：klu突變體。B：野生型擬南芥與klu突變體的分枝數目統計(n>18)；WT：野生型；klu：klu突變體。圖4和圖5同。**表示野生型擬南芥與klu突變體的分枝數目在0.01水平上差異顯著。

2.3 TaKLU基因過表達對擬南芥頂端優勢的 影響

對野生型擬南芥和35S::轉基因擬南芥(以株系35S::-1為研究對象)的株型進行比較，結果(圖4A)發現，35S::轉基因擬南芥的株高明顯高于野生型擬南芥，且主莖遠遠高于分枝，表現為頂端優勢的加強。此外，基因過表達還會抑制分枝的產生，即分枝數目明顯減少(圖4B)。進一步比較野生型擬南芥、35S::轉基因擬南芥和突變體的總分枝數目，結果顯示，與野生型擬南芥相比，35S::轉基因擬南芥的分枝數目顯著降低(除株系35S::-3與野生型差異不顯著)，降幅約為14%～34%，進一步說明了基因過表達可使頂端優勢加強(圖4B和4C)。綜合以上結果表明，過表達小麥基因能夠增強擬南芥的頂端優勢，減少擬南芥的分枝數目。

A：TaKLU基因過表達對擬南芥頂端優勢的影響；B和C：不同株系的分枝情況(B)以及分枝數目的統計(C，n>17)。*和**分別表示該株系與野生型擬南芥的分枝數目在0.05和0.01水平上差異顯著。

2.4 不同啟動子驅動小麥TaKLU回補klu突變體后擬南芥的形態

鑒于小麥基因過表達和擬南芥基因功能缺失后，擬南芥的株型呈相反的效應，即分別表現為頂端優勢的加強和減弱，推測基因可能在調控植物株型方面功能保守。為了驗證這個推測，利用不同啟動模式的啟動子回補突變體，獲得擬南芥pKLU::;、35S::;、pINO::;回補株系，并以野生型擬南芥和突變體為對照進行表型觀察。結果(圖5)顯示，由擬南芥基因自身啟動子pKLU驅動小麥基因在突變體中表達，能夠恢復突變體的表型，表現為pKLU::;回補株系的株高、分枝數目、葉片和花序大小與野生型擬南芥無明顯差異。與突變體相比，由強啟動子35S和特異啟動子pINO驅動基因在突變體中表達的35S::;和pINO::;回補株系均表現為株高明顯升高，與野生型擬南芥相比，分枝數目有所增加，分別為野生型的1.4和2.6倍，其中pINO::;回補株系與野生型擬南芥之間的分枝數目差異達到極顯著水平。所有基因回補株系的頂端優勢都得到了加強，其中pINO::;回補株系的頂端優勢加強的效應最為顯著，其主分枝較其他分枝明顯伸長(圖5A)，這也進一步支持了過表達基因能夠加強頂端優勢的結論。以上結果表明，和基因在調控株型上功能保守，均具有正調控植株頂端優勢的功能。

A：不同啟動模式下小麥TaKLU回補klu突變體的表型；1：野生型；2：pKLU::TaKLU;klu；3：35S::TaKLU;klu；4：pINO::TaKLU;klu；5：klu突變體。B：不同株系的分枝數目(n=6)。**表示該株系與野生型擬南芥的分枝數目在0.01水平上差異顯著。

2.5 KLU基因對擬南芥產量的影響

通過對野生型擬南芥、35S::轉基因擬南芥以及突變體的單株產量進行調查，結果(表2)發現，與野生型擬南芥相比，35S::轉基因擬南芥的單株產量與野生型無顯著差異，而突變體的單株產量極顯著下降，降幅為 50.8%。這說明基因不僅影響植物株型，還影響擬南芥的單株產量。

表2 TaKLU基因過表達對擬南芥產量的影響Table 2 Effect of TaKLU gene overexpression on Arabidopsis yield

3 討 論

在被子植物中，頂端優勢和分枝數目在很大程度上決定了植物的株型，并影響植物的營養分配、株高、產量等。作物的馴化也常常涉及株型和頂端優勢的變化，通過選擇抑制或促進芽的形成來減少或增加分枝數目，進而改變作物的株型和頂端優勢。擬南芥基因具有調控葉片和花序生長與發育的功能，其突變體表現為葉片和花序變小，本研究發現，擬南芥基因的功能缺失導致植株株高降低和頂端優勢弱化、分枝數目增加、器官變??；相反地，采用組成型強啟動子35S驅動小麥基因在擬南芥中過表達，可使擬南芥株高增加和頂端優勢增強，分枝數目減少、器官增大(數據未展示)，表明基因對植物株型具有調控作用。本研究通過回補試驗，觀察分析了pKLU::;、35S::;、pINO::;回補株系與野生型擬南芥和突變體的表型差異，發現所有基因回補株系的頂端優勢都得到了加強，其中pINO::;回補株系的頂端優勢加強的效應最為顯著，其主分枝較其他分枝明顯伸長，進一步證實了基因在調控植株株型和頂端優勢方面功能保守，為基因在作物株型遺傳改良方面奠定基礎。

本課題組前期研究發現，基因具有正調控種子大小的功能，而擬南芥基因缺失導致種子大小和結實率顯著降低，暗示盡管過表達基因會引起種子增大，但過表達基因還會導致頂端優勢加劇、分枝數目降低，很可能抵消種子增大對產量增加的正效應，本研究中35S::轉基因擬南芥的單株產量較野生型無明顯差異，可能就是以上原因造成的。相反，盡管突變體表現為分枝數目增加，但籽粒變小、結實率和頂端優勢降低對產量降低具有更強的負效應，本研究中突變體的單株產量較野生型降低了50.8%，推測可能也是這個原因造成的。Adamski等研究發現，對擬南芥中基因進行過表達和敲除，均會導致產量顯著降低。因此，適當的頂端優勢和合適的分枝數目才有利于作物產量的提高。鑒于此，Guo等對小麥基因的利用提出了新的策略，即在小麥籽粒發育階段通過局部過表達基因，達到在不影響小麥株型的前提下增加粒重，實現了單株產量顯著增加的目的。但該研究并未實現基因在株型改良上的應用。綜上，基因作為一種在單子葉和雙子葉植物中功能保守的株型調控因子，在作物株型遺傳改良育種中仍需要進一步的探索。

目前，研究者普遍認為，頂端優勢和分枝數目受激素水平調控。例如，基因編碼一種色氨酸轉氨酶，水稻突變體由于內源生長素分泌減少，導致頂端優勢減弱?；蚓幋a脫落酸生物合成酶，過表達水稻基因可通過參與獨腳金內酯對腋芽的調控，從而減少水稻分蘗，調控植株形態。本課題組前期研究也發現，小麥基因在調控器官發育過程中可影響生長素代謝通路，改變生長素的積累，推測基因調控植物頂端優勢和分枝數目與激素調控也有關系，但相關機制仍需進一步深入研究。