分子診斷實驗室核酸污染清除方法研究

王 哲，秦怡璠，王一萍，曾杰生

（1.廣東順德工業設計研究院（廣東順德創新設計研究院），廣東 佛山 528311；2.佛山丁智生物科技有限公司，廣東 佛山 528311）

2019 年12 月份新冠疫情發生后，疫情在全球的大流行對各國公共衛生和全球經濟造成嚴重威脅，了解和遏制新冠病毒的環境傳播模式對各國制定相關公共衛生政策至關重要［1］。早發現并進行流動性管控是快速控制新冠病毒傳播的方法，新冠病毒核酸熒光定量 PCR 檢測由于其高靈敏度和準確性成為公認的金標準［2］。

DNA 在生活和工作環境中普遍存在，人們說話、打噴嚏、咳嗽，即使戴著口罩也會引入 DNA，普通的污染途徑包括通過離體唾液、灰塵及氣溶膠等介質的傳播方式，或是樣本受到污染［3］。在分子實驗室，造成假陽性的原因有多種，比如實驗操作不規范［4］，實驗室管理不當［5］，但更多的核酸污染是重復進行 PCR 擴增實驗，擴增產物會在實驗室環境中累積，一個 PCR 反應產物能產生多達109個拷貝的靶序列的 PCR 實驗，如果產物被霧化，即便是最小的氣溶膠體也會包含106個擴增產物以上，在短時間內，氣溶膠產物擴散累積將污染整個實驗室的試劑、耗材設備和通風系統［6］。一般利用紫外光照射和高壓滅菌來處理實驗耗材中的 DNA 污染，有實驗證明，高壓滅菌（128 ℃，420 min）后，再次干燥，暴露于10～60 J/cm2的紫外光照射下能夠清除，但此方法耗費時間長并且紫外線透射度有限、高壓滅菌對耗材有選擇性等局限［7-8］。無菌醫療產品常用環氧乙烷（EO）氣體來滅菌，通過 EO 處理 3 h可使 PCR 擴增的 DNA 減少 104個數量級，因此利用 EO 來阻止 DNA 擴增的方法是有效的，但是 EO并不能完全清除 DNA 污染，且作用后會有副產物遺留，導致這種方法難以在分子實驗室應用［9-10］。因此，需要尋求一種更便捷的辦法來預防或減少核酸污染。核酸清除劑是目前市面上商品化使用的專門清除核酸污染的試劑，針對性強、效果好且毒性小。核酸清除劑是通過產生活性氧自由基，達到對核酸片段氧化降解目的。本文采用了含有雙氧水、抗壞血酸、酸堿緩沖液及起到催化作用的金屬陽離子的核酸清除劑，分別測試了DNA 清除劑對長片段和PCR 產物的短片段的降解效果、對氣溶膠的處理效果、對桌面儀器表面的處理效果來分析核酸的降解能力。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑和設備

1）主要試劑見表1。

表1 主要試劑及試劑品牌

2）主要設備見表2。

表2 主要儀器名稱及品牌

1.2 實驗步驟

1）配制DNA 清除劑。

配制1 L pH 為3 的0.2 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。檸檬酸稱取35.74 g，檸檬酸鈉稱取4.12g；取檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液900 mL，稱取 L-抗壞血酸17.612 g 使其濃度達到0.1 mol/L，攪拌溶解；稱取 CuSO4·5H2O 使其濃度達到0.02 mol/L；加30 % H2O26 mL，使其達到 0.000 1 mol/L；加EDTA 3.36 g，使其濃度達到0.01 mol/L；將整體溶液補足至1 L；置于 4 ℃ 保存備用。

2）DNA 提取。

將鼠傷寒沙門氏菌接種于 LB 培養基中，37 ℃、150 r/min 搖床培養 8 h，沙門氏菌各取 500 μL 菌液（108CFU/mL），根據 DNA 提取試劑盒說明書提取DNA，保存于 -20 ℃ 備用。

3）凝膠電泳。

使用瓊脂糖凝膠電泳進行實驗，配制 1.5 % 瓊脂糖凝膠，使用 1 mm 齒梳。分別取沙門氏菌高分子量DNA 和擴增過后的低分子量 DNA 各 5 μL，與等體積的DNA 清除劑反應 20 min 后作為待測樣品，高分子量 DNA 和低分子量 DNA 使用不同的 Marker，分開進行電泳。Marker 加樣量為 6 μL，樣品加樣量為9 μL。電壓 130 V，20 min。

4）樣本采集。

選擇 PCR 實驗室污染嚴重的區域并對關鍵實驗區域及儀器耗材進行采樣。我們選擇冰箱、離心機、桌面、門把手、超凈工作臺及移液槍 6 個區域，使用 PCR 級水浸濕棉簽拭子，對目標區域進行旋轉涂抹擦拭，6 個區域分別選擇 1 個位點作為采樣區域，將擦拭處理過的棉簽溶于裝有 500 μL PCR 級水的離心管中。對實驗室環境使用DNA 清除劑進行徹底清潔，處理后以上述同樣的方式進行取樣。

5）DNA 清除劑對 PCR 的抑制效果測定。

向 PCR 反應體系中加入DNA 清除劑或取其稀釋液 5 μL；將體系補足至 20 μL。DNA 清除劑稀釋，按照 10 的倍數進行稀釋，稀釋 5 個級別。

6）DNA 清除劑降解效率測試。

取 5 個 EP 管，向管中加 10 μL DNA 樣本，并編號 1～5，向 1、2 管中加雙蒸水 20 μL，向 3～5 管中加 DNA 清除劑 20 μL，靜置 20 min 后將 5 個孔中的試劑全部吸出，用 20 μL 雙蒸水進行清洗，清洗兩遍，取第二次的水為樣本，進行 PCR 擴增。

7）PCR 反應。

準備沙門氏菌上游引物 invA-F（5’TGCGAGTGG TAAATTATTCCGAT3’）和 下 游 引 物 invA-R（5’GCCA GACAGTGGTAAAGCTC3’）進行PCR 產物擴增，以提取的沙門氏菌 DNA 為模板，反應體系為 20 μL，分別是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 上下游引物各1 μL，模板 DNA 1 μL，補充水至 20 μL。擴增程序PCR 反應條件為 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1min，40 個循環。反應后的產物 -20 ℃保存備用。

本實驗中 qPCR 的反應體系為 20 μL，分別是：PCR Buffer 10 μL，10 μmol/L PCR 引物各 1 μL，模板 DNA 5.5 μL，補充水至 20 μL。PCR 反應條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，40 個循環。

2 實驗結果

1）DNA 清除劑對長片段和短片段的降解。

經過 PCR 后，產物長度大約 200 bp，提取的核酸片段長度超過 10 000 bp。如圖1 所示，（a）為DNA 清除劑作用于短核酸片段的實驗，（b）為作用于長片段核酸的實驗，其中泳道 1 為對照組，泳道 2為實驗組。經過核酸清除處理后，對照組均有明顯的條帶，實驗組完全看不出電泳條帶，說明本文中的 DNA 清除劑具有較強的核酸降解能力。經分析，該試劑在反應過程中能夠產生較多的羥基自由基，產生的羥基自由基能夠與核酸片段快速結合，從而發生降解反應，從而達到降解效果。

圖1 DNA 清除劑降解核酸后電泳圖

2）DNA 清除劑對 PCR 的抑制作用。

將 DNA 清除劑稀釋10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍、100 000 倍及以上進行實驗，分別將稀釋的清除劑與 DNA 模板進行等體積混合，取5 μL 作為模板進行 qPCR 擴增。

圖2 為 DNA 清除劑對 PCR 擴增的抑制反應。其中曲線a 指未稀釋的 DNA 清除劑檢測結果，曲線b 指稀釋 10 倍的 DNA 清除劑檢測結果，曲線c 指稀釋 100 倍及更大倍數 DNA 清除反應，曲線d 為未加DNA 清除劑。添加 DNA 清除劑的測試結果顯示，高濃度的 DNA 清除劑對 PCR 反應具有明顯的抑制作用，如圖2 中曲線 a 和 b，當稀釋到 100 倍以后，適當的濃度可能有助于 PCR 擴增，抑制作用不明顯，如圖2 中 c 組擴增曲線。與曲線d 對比，適當濃度的DNA 清除劑可能有助于PCR 擴增。

圖2 DNA 清除劑對 PCR 擴增的抑制

3）DNA 清除劑清除效率。

在測試DNA 清除劑對核酸的降解效率中，處理組與對照組的Ct值出現明顯的差異如圖3。其中曲線A 為帶有閾值線的擴增曲線，曲線B 為去掉閾值線的擴增曲線，a 為陰性對照，b 為陽性對照，c 為對照組第1 次處理取樣，d 為對照組第 2 次清洗取樣，e 為DNA 清除劑組第 2 次清洗取樣，f 為DNA清除劑組第 1 次處理取樣。實驗中陽性對照可能是樣本濃度過高造成擴增曲線異常，對比不設置閾值熒光曲線，確定陽性擴增曲線是可信的，如圖3 所示。在雙蒸水處理做為對照組實驗數據中顯示，第一處理的Ct（＜1）和第二次清洗取樣的Ct（＞10），根據PCR 擴增模型，Ct值相差 3.32 濃度相差10 倍，說明第一次處理到第二次取樣的稀釋倍數大于1 000倍，即推測 DNA 清除劑處理組的稀釋倍數也大于1 000 倍，根據 DNA 清除劑對 PCR 抑制試驗數據分析，第二次清洗取樣時，可以忽略殘存 DNA 清除劑對 PCR 的擴增。

圖3 DNA 清除劑對核酸的降解效率

實驗結果顯示，對照組的Ct分別是 9.65、9.69、10.08、10.15，平均值為 9.89；實驗組的Ct值為 23.68、23.49、27.72、27.61、25.17、25.42，平均值 25.51。根據DNA 清除率η=（1-（1/2^（CtDNA清除劑-Ct水）））*100%計算本研究中的 DNA 清除劑的清除率為99.99%，清除效果明顯。

4）DNA 清除劑對實驗室處理效果測試。

對實驗室的桌面、移液槍等取樣，進行熒光定量 PCR 測試，得到結果圖4，圖4 為DNA 清除劑處理前后擴增曲線，A 為桌面，B 為移液槍，C 為離心機，D 為冰箱門，E 為門把手，F 為超凈工作臺。結果顯示，核酸清除劑處理桌面、移液槍、離心機和門把手后，檢測的Ct值均出現明顯的增大，靶標濃度降低，說明核酸清除劑具有降解核酸的作用，對冰箱門和超凈臺處理前后的Ct變化較小，超凈臺內部屬于相對干凈的區域可能是前后Ct變化不大的原因，冰箱可能和接觸的次數的多少和試劑處理相關，如圖4 所示。

圖4 DNA 清除劑處理前后擴增曲線

3 結論

隨著核酸檢測技術的成熟，各個高校、研究所、生物檢測公司及醫院等大部分都設有 PCR 實驗室，PCR實驗室非常容易發生污染，為防止出現假陽性或假陰性的結果，實驗室一般都會規定相應的條款措施來預防，比如在實驗室根據污染可能性合理劃分實驗區域、選擇無菌實驗耗材、選擇質量較好的試劑盒進行實驗、超凈工作臺或實驗室經常進行紫外線照射、實驗后的耗材垃圾按時清潔、部分耗材試劑進行高壓滅菌［11］。本文提供了一種高效的DNA 清除劑，處理過的長片段和短片段核酸，均有效被降解，用其處理實驗室的表面，檢測后的Ct均降低，說明本研究中提供的 DNA 清除劑可以作為分子擴增實驗室清潔劑使用。