超高效液相色譜-串聯三重四極桿串聯質譜法 測定細辛中的4種馬兜鈴酸

歐愛芬，黃嘉樂，董楊靜，趙肅清

（1.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東廣州 511400）（2.廣州城市職業學院食品科學與美食養生學院，廣東廣州 510405）（3.廣州檢驗檢測認證集團有限公司，廣東廣州 511440）

馬兜鈴酸是一類硝基菲羧酸，主要存在于馬兜鈴科的馬兜鈴屬和細辛屬植物中[1-4]。在我國馬兜鈴科植物經過炮制解毒入藥已有幾千年歷史，在南朝時期唐甑所著的《藥性論》中，就有馬兜鈴的入藥記載，如馬兜鈴性平，能主肺氣上急，坐息不得，主咳逆連連不可止[5,6]。1964年，吳松寒[7]對2例急性腎衰竭的患者進行診斷發現，均是因為大劑量服用關木通所導致。1992年，比利時病理醫師對兩位腎功能不全者的患者研究發現，他們均在同一家減肥診所接受減肥治療，隨后研究人員對他們服用的減肥膠囊進行成分檢查測，被證實減肥膠囊種含有馬兜鈴科植物廣防己。同時也從受害者的腎組織種分離出馬兜鈴-DNA加合物，該事件被國際醫學界關注，繼而對馬兜鈴酸展開全面研究，并被稱為“馬兜鈴酸腎病”[8-10]。2012年國際癌癥研究組織將馬兜鈴酸及含有馬兜鈴酸的植物被列為一類致癌物[11,12]。近年，對多瑙河地區性家族性腎病研究發現，馬兜鈴酸隨著植物腐爛進入土壤后能夠抵制植株中酶體系及土壤微生物對其的分解作用，被土壤種植的植物吸收而產生富集[13,14]，因此馬兜鈴酸不單是一種藥源性疾病，同時還是環境污染所致的食源性疾病。2020年版《中國藥典》收錄的細辛，不單作為中藥材用于中醫，并且在民間作為一種煲湯食材用于溫肺止咳化痰、益氣祛風、散寒止痛的食療方法。

目前馬兜鈴酸的檢測方法主要是色譜，包括薄層色譜、高相液相色譜、液質聯用等，其中薄層色譜主要用于定性[15,16]；高相液相色譜可以用于定性和定量[17-20]，但是由于中藥材成分的復雜性，在分離過程中很難排除其他成分的干擾，存在一定的局限性；液質可以準確地用于定性和定量，但是目前關于液質檢測馬兜鈴酸的含量，主要集中在含量較高毒性最強的馬兜鈴酸A上[21-26]。隨著對馬兜鈴酸結構進一步研究后發現，馬兜鈴酸主要結構除了馬兜鈴酸A以外，還有馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D，其結構差異主要是甲氧基或者羥基的位置不同[27]。馬兜鈴酸的毒性與其結構有關，硝基是馬兜鈴酸類衍生物中最主要的毒性基團，此外羥基的存在可以使馬兜鈴酸的毒性進一步加強，其中馬兜鈴酸A的毒性最強，馬兜鈴酸B也具有一定毒性，而其他成分的腎毒性和致癌性差異尚不明確[28]。因此建立同時測定馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D的液質方法，并對目前市售細辛及含有細辛的8種中成藥中四種馬兜鈴酸含量進行分析，對細辛的食用及藥用安全，以及及含細辛中成藥的質量控制具有重要意義。

超高相液相色譜（UPLC）相對于高效液相色譜，其可以在工作壓力超過6000 psi或工作溫度超過環境溫度的下應用，可以使用填充顆粒更小的色譜柱，不僅可以實現更高的分辨率，同時還能縮短整體的分析時間。質譜分析具有靈敏度高，準確性好，定性和定量能同時準確檢測等優點。三重四級桿質譜儀利用母離子和子離子的共同特征，定量選擇性高。因此，本文建立了同時快速測定中藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D四種物質的超高相液相色譜串聯三重四級桿質譜法（UPLC-QQQ-MS/MS），并對9個樣品中四種物質的含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、甲酸，均為色譜純，德國Merck公司；馬兜鈴酸A（CAS：313-67-7），羅恩試劑；馬兜鈴酸B（CAS：475-80-9）、馬兜鈴酸C（CAS：4849-90-5）、馬兜鈴酸D（CAS：17413-38-6）標準品均購于中國廣州測試中心；9種試驗用藥，市售。

島津LC-30A超高效液相色譜儀，日本島津；高效液相色譜-串聯質譜儀，美國AB Sciex公司；AB Sciex 5500三重四級桿質譜儀，（配備電噴霧離子源（ESI），software version: Analyst.7.1），美國AB SCIEX公司；十萬分之一電子天平，美國梅特勒公司；高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；渦漩振蕩儀，德國IKA公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流動相：甲醇，含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫。梯度洗脫參數見表1；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：5 μL。

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+源）；檢測方式：多反應監測（MRM）；掃描方式：正離子模式掃描[29]；氣簾氣（CUR）：30 μL/min；離子化電壓（IS）：5500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴霧器（GS1）：50 psi；輔助加熱器（GS2）：50 psi；噴撞氣（CAD）：9 psi；碰撞電池入口電壓（EP）：10 V；碰撞電池出口電壓（CXP）：13 V；倍增光電壓（CEM）：2100 V；采用多反應監測（MRM）模式采集數據，質譜參數見表2。

表2 馬兜鈴酸A、B、C、D質譜分析參數Table 2 The MS condition for determination of four aristolochic acids

1.2.3 對照品溶液的制備

（1）標準儲備液：精密稱取馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D各0.0050 g（精確至0.00001 g），置于100.00 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為50.00 mg/L標準儲備液，4 ℃保存。

（2）混合標準中間液：分別準確量取0.20 mL馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D上述標準儲備液，置于10.00 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D濃度為1.00 μg/mL的混合標準中間液，4 ℃保存。

（3）混合標準工作液：準確吸取4種馬兜鈴酸標準中間溶液4.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μL，分別用70%甲醇水定容至1.00 mL，配制得到4.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00 μg/L系列濃度標準工作曲線。臨用前配制。

1.2.4 樣品溶液的制備

（1）液體試樣：選取10支混合均勻，精密量取1.00 mL液，置于50.00 mL容量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，超聲30 min，放冷，用70%甲醇定容至刻度，用0.22 μm有機系濾膜過濾，作為供試品溶液。

（2）固體試樣：取10片或者適量研磨成粉狀后，精密稱取1.00 g試樣，置于50 mL容量瓶中，加入40 mL 70%甲醇，超聲30 min，放冷，用70%甲醇定容至刻度，用0.22 μm有機系濾膜過濾，作為供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 流動相系統的選擇

馬兜鈴酸A、B、C、D是一類硝基菲羧酸，結構類似，為了獲得四種目標物最好的分離分析效果，考察了甲醇-0.1甲酸水溶液、乙腈-0.1甲酸水溶液以及二氯甲烷-0.1甲酸水溶液作為流動相進行分析。結果顯示，甲醇和乙腈由于極性大，具有較好分離效果；而二氯甲烷極性較小，無法有效洗脫吸附在色譜柱上的待測物。但是，考慮到環境污染，人員健康問題，最后選用了甲醇作為流動相，對馬兜鈴酸類物質進行檢測。

2.2 色譜柱的選擇

選用了Welch AQ-C18（4.6 mm×100 mm，5 μm）、Phenomenex Luna NH2（4.6 mm×100 mm，3 μm）、Phenomenex KinetexC18（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）等常用的4種液相色譜柱。通過對四種物質的混合標準溶液進行進樣分析發現，NH2柱（圖1a）對馬兜鈴酸類物質的保留較強，無法達到預期實驗效果；AQ-C18（圖1b）柱及C18（圖1c）對馬兜鈴酸類物質的分離能力較差；T3（圖1d）對4馬兜鈴酸類物質的分離效果較理想，故選用Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）作為四種物質的分離色譜柱。

2.3 線性關系

將1.2.3中配制的混合標準工作液在1.2.1與1.2.2項條件下測定（圖2、圖3），出峰的先后順序依次是馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸A，以標準品溶液的濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標進行線性擬合，馬兜鈴酸A、B、C、D的線性方程分別為：y=0.2133x+0.2227（R2=0.999）；y=0.0916x+ 0.0615（R2=0.9981）；y=0.0575x+0.0245（R2=0.999）；y=0.0081x-0.0079（R2=0.9967）。四種物質在4.00～100.0 μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數均在0.995以上。并以信噪比（S/N=3）來確定馬兜鈴酸A、B、C、D最低檢出限，分別為3.00、5.00、25.00、20.00 μg/kg。

2.4 精密度

將濃度為40 μg/L混合標準工作液重復進樣6次進行檢測，結果如表3。測得馬兜鈴酸A、B、C、D的峰面積RSD分別為1.41%、1.54%、1.73%、1.26%，表明該儀器精密度良好。

表3 精密度實驗結果（n=6）Table 3 The results of precision (n=6)

2.5 穩定性

取細辛粉末適量，按1.2.4固體試樣制備供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h對樣品進行測定[30]，記錄色譜峰面積，并計算各組分的含量。結果如表4，馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C均未檢出，馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的RSD值分別為1.22%、0.67%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

表4 穩定性實驗結果（n=6）Table 4 The results of stability (n=6)

2.6 重復性

取同一批次細辛藥材磨成粉末，精密稱取6份，按按1.2.4固體試樣制備供試品溶液，并進行測定，記錄色譜峰面積，并計算各組分的含量。結果如表5，馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C均未檢出，馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的RSD值分別為1.42%、0.31%，表明該方法重復性好。

表5 重復性實驗結果（n=6）Table 5 The results of repeatability (n=6)

2.7 加樣回收

取同一批次細辛藥材磨成粉末，精密稱取9份樣品，加入一定量的混合標準中間液，配制成高、中、低的加標溶液，按1.2.4制備供試品溶液，進行測定，其中馬兜鈴酸D在1.2.4的基礎上再稀釋10倍進行測定，計算其加標回收率及RSD，結果如表6所示。結果表明，四種物質的3個不同濃度加標回收率均在91.97%～106.40%之間，RSD均小于4.24%，可滿足檢測要求。

表6 加標回收率（n=9）Table 6 The results of recovery (n=9)

2.8 樣品測定

精密稱取適量樣品，按1.2.4制備供試品溶液，用外表法計算四種物質的含量，結果見表7。從結果可以看出含有細辛及細辛類中成藥中除了含有馬兜鈴酸A還有一定量的馬兜鈴酸D，且都不含有馬兜鈴酸B及馬兜鈴酸C，細辛中成藥中馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D兩種成分的含量均低于細辛原材料。

表7 9種中藥材的檢測結果Table 7 Test results of 9 kinds of Chinese medicinal materials samples (ˉx±s, μg/kg, n=3)

3 結論

3.1 本文建立里了超高相液相色譜串聯三重四級桿質譜法，用于同時測定樣品中四種馬兜鈴酸（馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D）含量，在4～100 μg/L濃度范圍內線性關系均良好（r≥0.995），檢出限分別為3.00 μg/kg、5.00 μg/kg、25.00 μg/kg、20.00 μg/kg，加樣回收率在91.97%～106.40%之間，RSD≤4.24%（n=9）。該方法專屬性強，準確度和精密度高，線性范圍廣，適用于樣品中四種馬兜鈴酸的同時檢測。并用該方法對目前市售的細辛及8個含細辛中成藥進行了這四個成分的含量測定，細辛及8個含細辛的中成藥均含有不同程度的馬兜鈴酸A或馬兜鈴酸D，均未檢出馬兜鈴酸B和馬兜鈴酸C。同時細辛中成藥中馬兜鈴酸A和馬兜鈴酸D的含量均低于細辛藥材，且細辛及細辛中成藥中馬兜鈴酸A的含量均低于《中國藥典》規定的每克含量不得超過0.001%，符合安全使用標準。2007年，李偉等[31]對細辛及養血清腦顆粒中馬兜鈴酸A進行測定，發現細辛中含有微量的馬兜鈴酸A，而以細辛為原料的養血清腦顆粒中卻沒有檢測到馬兜鈴酸A，因為中成藥在配伍和提取制劑過程中具有減毒增效的作用。2017年，李功輝等[32]采用UPLC-QQQ-MS對不同藥材中的馬兜鈴酸A進行測定，其中細辛類藥材中馬兜鈴酸A的含量均小于10 μg/g。

3.2 目前從馬兜鈴科植物中提取的含馬兜鈴酸類結果的化合物有160多個，最基本的結構有馬兜鈴酸A、馬兜鈴酸B、馬兜鈴酸C、馬兜鈴酸D四種，在細辛及含細辛的中成藥中除了檢出馬兜鈴酸A外，還含有一定量的馬兜鈴酸D。2018年，丁慧等[33]采用UPLC-MS/MS對天仙藤、青木香、馬兜鈴、尋骨風、朱砂蓮五種藥材中的四種馬兜鈴酸含量進行測定，結果顯示四種物質在五種藥材中的含量有較大的差別。這提示我們在研究細辛類中藥材在食用及藥用的安全性時，不能只關注馬兜鈴酸A，還應該關注馬兜鈴酸D。