基于高通量測序的象山港水域細菌多樣性的研究*

劉 巖 李志恩 袁一鳴 張 真 錢鵬宇 葉 歡 劉松怡王 澤 韓姣姣 周 君 蘇秀榕①

(1. 寧波大學海洋學院 浙江寧波 315211; 2. 國家海洋局東海環境監測中心 上海 201206; 3. 浙江正合谷生物科技有限公司 浙江寧波 315048)

象山港位于浙江省寧波市東南部沿海, 是一個由東北向西南深入內陸的狹長型半封閉型海灣, 港內地形復雜, 水產資源豐富, 是重要的以海水養殖區和海洋牧場示范區為主的多功能水域, 也是著名的避風良港, 其地處29°24′～29°46′N 和121°25′～122°00′E的范圍內。由于象山港海域深淺寬窄不一, 是浙江省最重要的海水增養殖基地, 也是重要的漁業資源保護區(江志兵等, 2013)。近年來由于陸源污染(童晨等,2018)和水產養殖污染(Hanet al, 2013; 吳燕妮等,2017)等人為活動的干擾, 給原本就較為脆弱的海灣生態系統造成巨大壓力, 生態環境問題日益突出。我國非常重視資源的保護, 更關注海洋的生態環境。海水中微生物種類較多, 是自然界最重要的分解者, 對維持生態平衡和物質循環有著重要作用。有些微生物可以有效降解水內的有毒物質; 有些致病微生物能夠控制它們的寄主的數量, 甚至影響寄主的進化方向; 有些微生物之間存在著某種相互作用, 對維持水內生態環境的穩定性意義重大。為了掌握象山港細菌的多樣性, 本文利用高通量測序技術研究象山港早春低溫海水環境中的微生物多樣性, 以期為海洋環境保護、水產養殖病害的防護奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于 2021 年 3 月(春季)對象山港中部海域(121°43′06″E, 29°34′44″N) (G04)、象山港西滬港海域(121°47′20″E, 29°31′40″N) (G06)、象山港中部海域(121°35′52″E, 29°31′00″N) (G08)、象山港鐵港口海域(121°30′43″E, 29°30′21″N) (G09)、象山港西滬港口海域(121°45′42″E, 29°32′38″N) (G11); 象山港黃墩港海域(121°31′37″E, 29°26′45″N) (G12)的6 個取樣點的0.5 m 深海水進行取樣檢測。

1.2 樣品的處理和測序

采集的水樣帶回實驗室后, 取 1 L 的水樣經0.22 μm 的無菌纖維素濾膜真空抽濾, 濾膜取出放置于15 mL 的無菌離心管中, 并將樣品送至杭州聯川生物技術股份有限公司進行16S rRNA 高通量測序。選擇CTAB 法對微生物組樣本進行微生物組總 DNA的提取, 并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 質量, 紫外分光光度計進行DNA 定量。PCR 擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測, AMPure XT beads 試劑盒回收產物。對純化后的PCR 產物使用Agilent 2100生物分析儀(Agilent, 美國)和Illumina (Kapa Biosciences,Woburn, MA, 美國)的文庫定量試劑盒進行評估。將合格的文庫梯度稀釋后(Index 序列不可重復), 根據所需測序量按相應比例混合, 并經NaOH 變性為單鏈利用NovaSeq 6000 測序儀進行2×250 bp 的雙端測序。

1.3 可培養細菌的鑒定

將6 個取樣點的海水進行10×稀釋后分別涂布于海水牛肉膏、海水大豆蛋白培養基、2216E 和TCBS固體培養基上28 °C 培養。待12～16 h 菌落長出后按照形態、大小和顏色進行平板劃線分離純化。

分別挑取純化后細菌單菌落的DNA 作為模板,利用16S rRNA 通用引物27F (5′-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGT TACGACTT-3′)進行PCR 擴增后產物送到上海生工測序。

2 結果與分析

2.1 測序結果

利用高通量測序共獲得836 屬和2 166 種細菌,它們隸屬33 個門、91 個綱、186 個目和352 個科。通過去重復獲得高精度單堿基代表序列, 然后使用ASVs (amplicon sequence variants) 構 建 OTU(operational taxonomic units), 獲得最終的feature 特征表以及特征序列, 并進行多樣性分析、物種分類注釋和差異分析等。根據不同的相似度、feature ID 進行分析?；ò陥D可清晰地看出各取樣點之間物種豐富度的差異, G04、G06、G08、G09、G11 和G12 特有的菌種分別有1 089、880、1 113、513、447 和628個, 共有的菌種有213 個; 其中G08、G04 和G06 細菌豐富度較高(圖1)。

圖1 象山港細菌種類差異分析Fig.1 Analysis on the difference of bacterial species in Xiangshan harbor

2.2 象山港菌群多樣性分析

圖2 的?；鶊D用來展示數據的“流動”變化, 分支的寬度表示流量的大小。圖中展示了不同樣本(左側)對應的門水平(中間)和屬水平(右側)的菌群相對豐度,直觀展示菌群多樣性研究中最為關注的兩個層級的物種注釋信息、對應關系以及所占比例。從圖中可以看出象山港海域中的優勢菌群包括弧菌屬(Vibrio)、大西洋美女神菌屬(Amphritea)和假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas), 其中假交替單胞菌屬在變形菌門中豐度最高, 其次是弧菌屬; 而假交替單胞菌屬在G09 中豐度最高, 在G04 中豐度最低; 弧菌屬和大西洋美女神菌屬主要來自G04 (圖2)。

圖2 象山港海域細菌種屬水平差異分析Fig.2 Analysis of bacterial species and genera in the sea area of Xiangshan harbor

玉 玦圖通過角度來表示每個 玦環數值的大小,角度是決定性因素。通過分析玉 玦圖可以清晰地看到各個海域中的門、綱、目、科、屬和種水平的豐度情況。根據每個水平所占的角度大小分析得知, G09、G11 和G12 在各水平的豐度水平相近, G04、G06 和G08 之間的豐度差距也不明顯; 經兩兩相比得知G08的物種豐度最高, G11 的物種豐度較低, 并且這種差異主要體現在種屬水平上(圖3)。

圖3 象山港海域細菌各分類水平豐度分析Fig.3 Analysis on the richness of bacteria at different classification levels in the sea area of Xiangshan harbor

2.3 象山港菌群豐度分析

將綱水平相對豐度最高的13 個群落數據根據分類單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類, 并對分類單元和樣本分別排序。其中γ-變形菌綱 (Gammaproteobacteria) 和 α- 變 形 菌 綱(Alphaproteobacteria)在各海域中豐度較高; 隨著緯度的上升, 海域中γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)流動性增高, 其中在G04 取樣點中高達72.76%, 在G12為29.11%, 最低(圖4)。

圖4 象山港海域綱水平上細菌群落結構組成分析Fig.4 Analysis on the composition of bacterial community at levels of class in the sea area of Xiangshan harbor

2.4 種類組成和分布

為進一步準確了解象山港海域細菌群落結構組成, 并揭曉不同取樣點的差異, 我們分別根據分類學的門、綱、目、科、屬和種水平繪制累計柱狀圖, 分析各取樣點細菌群落結構特點。

累計柱狀圖顯示變形菌門在G04、G06、G08、G09、G11 和G12 中的豐度最高, 分別為91.45%、76.18%、73.94%、71.33%、86.76%和57.00%; 其次是擬桿菌門, 所占比例為3.74%、7.59%、13.92%、18.05%、6.01%、31.41%; 再次是放線菌門。與其他海域不同的是, 在G06 中藍藻門豐度高于放線菌門豐度(圖5a)。

圖5 象山港海域門水平(a)和綱水平(b)細菌群落結構組成分析Fig.5 Analysis on the composition of bacterial community at levels of phylum (a) and class (b) in the sea area of Xiangshan harbor

在綱水平上, 6 個取樣點細菌種類中γ-變形菌綱的豐度都比其他綱所占比例高, 其中最高的是在G04(72.96%), 最低在G12 (29.11%); 其次是α 變形菌綱,最高在G11 (30.65%)。與其他6 個取樣點不同的是,在G12 中黃桿菌的豐度最高(30.74%); 此外分析發現,雖然在 G04 中弧菌豐度最高, 但是黃桿菌綱(Flavobacteriia)豐度最低; 在G12 中黃桿菌豐度最高且弧菌豐度最低, 并且弧菌和黃桿菌之間的豐度變化關系在G08、G09 和G11 中均有所體現(圖5b)。

在目水平上, 海洋螺菌目(Oceanospirillales)和弧菌目(Vibrionales)在 G04 中所占比最高(32.30%和18.72%), 在G12 中占比最低(4.39%和1.01%); 交替單胞菌目(Alteromonadales)在 G09 中所占比為29.08%, 遠高于G12 中交替單胞菌目的占比(16.00%);除 G12 中黃桿菌目占比 30.74%高于紅細菌目(Rhodobacterales) 19.76%外, 其他6 個取樣點的紅細菌目占比都高于黃桿菌目; 與其他取樣點不同的是G04 的優勢菌群為海洋螺旋菌目、弧菌目、交替單胞菌目和紅細菌目, 而其他取樣點的黃桿菌目豐度均高于弧菌目(圖6a)。

科水平上, 在 6 個取樣點中海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、弧菌科(Vibrionaceae)、紅細菌科 (Rhodobacteraceae) 、 假 交 替 單 胞 菌 科(Pseudoalteromonadaceae) 和 黃 桿 菌 科(Flavobacteriaceae)占比較多, 其中在G04 中海洋螺菌科和弧菌科豐度最高, 占比分別為31.19%和18.72%,而黃桿菌科豐度較低, 為2.72%; 在G12 中黃桿菌科豐度最高, 而弧菌豐度相對較低, 分別為22.32%和1.01%; 紅細菌科在G11 和G06 中占比最高, 分別是25.74%和20.42%; 從圖中我們了解到G08 和G12 中的假單胞菌科豐度接近, 分別為 14.46%和 14.20%(圖6b)。

圖6 象山港海域目水平(a)和科水平(b)細菌群落結構組成分析Fig.6 Analysis on the composition of bacterial community at levels of order (a) and family (b) in the sea area of Xiangshan harbor

在屬水平上, 以6 個取樣點中豐度占比前13 的細菌屬整合成累計柱狀圖進行對比分析發現, 在G04中大西洋美女神菌屬和弧菌屬占比最高, 分別為19.57%和18.19%, 假交替單胞菌屬占比(8.60%)明顯低于其他取樣點, 這可能與假交替單胞菌和弧菌之間的拮抗作用有關(楊行等, 2019); 在其他5 個取樣點中豐度最高的是假交替單胞菌屬, 在G09 的占比高達25.38%; 此外我們還發現各個取樣點中均分布著一定數量的海單胞菌屬(Marinomonas), G11 中8.25%, 占比最多, G12 中1.27%, 占比最少(圖7a)。

在種水平上, 共發現了2 166 種細菌, 其中豐度最高的是在 G04 中的大西洋美女神菌(Amphriteaatlantica) 和 G09 中 的 海 假 交 替 單 胞 菌(Pseudoalteromonas marina), 所占比例分別為19.76%和20.62%。在G04 中優勢菌包括大西洋美女神菌、燦爛弧菌(Vibrio splendidus) (8.98%)和海假交替單胞菌(5.74%), 除G04 以外的各取樣點中優勢菌群均為海假交替單胞菌(圖7b)。

圖7 象山港海域屬水平(a)和種水平(b)細菌群落結構組成分析Fig.7 Analysis on the composition of bacterial community at levels of genera (a) and species (b) in the sea area of Xiangshan harbor

2.5 細菌群落相似性分析

通過PCA 分析可得, 樣品的空間距離越接近,表示樣品的物種組成結構越相似。PCA 圖展現出G04與其他5 個取樣點的微生物組成結構相似性較小, 差異性較大, 其中G11 和G06、G08 和G09 聚集在一起,距離較近, 說明G11 和G06、G08 和G09 取樣點的細菌群落相似性較大, 而G12 與這4 個水域距離較遠,細菌差異性較大; 造成這種差異的可能原因是G11和G06, G08 和G09 分別處于緯度相鄰的地方, 生活環境和菌群間的互相影響; 而G04 與其他取樣點的距離較遠, 所處的環境和溫度有差異, 導致細菌群落的結構組成也會有所不同(圖8)。

圖8 象山港海域的菌群PCA 分析Fig.8 PCA analysis of microbiome in the sea area of Xiangshan harbor

2.6 可培養細菌的種類

基于細菌分離培養法, 通過對形態特征、生理生化反應等的分析比較, 對分離純化出9 種細菌, 經16S rRNA 測序結果分析, 6 個取樣點的可培養優勢細菌是溶藻弧菌(V. alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、燦爛弧菌(V. splendidus)、卡諾弧菌(V. kanaloae)、巨型弧菌(V. gigantis)、粗糙弧菌(V.crassostreae)、海假交替單胞菌(Pseudoaltermonas marina)、羅氏發光桿菌(Photobacterium rosenbergii)和魯氏發光桿菌(P. lutimaris), 其中弧菌大多來自G04 取樣點, 海假交替單胞菌主要來源于G09。這與高通量測序結果一致。

3 討論

目前研究的象山港水域生物種類主要為海洋浮游動植物及底棲動物, 對象山港水域微生物多樣性及群落分布的研究很少, 對早春低水溫環境下的細菌種類研究更少。高通量測序能有效描述微生物的群落特征, 對水樣的合理利用有著重要的參考價值。前期研究結果顯示象山海域優勢細菌類群為α-變形桿菌綱(39.45%)、γ-變形桿菌綱(47.48%)和擬桿菌門(7.76%) (胡常巨等, 2015)。本研究發現變形菌門和藍藻菌門是象山港水域3 月份的兩個優勢類群。其次是放線菌門和厚壁菌門, 這與前人研究結果一致(李秋芬等, 2013)。這些菌均屬于海洋沉積環境中常見的微生物(黃瑩等, 2020)。6 個不同水域取樣點的微生物種類都很多, 但因為所處地理位置及其周圍環境的不同, 也導致不同水域的優勢類群和多樣性有所差別。其中 G08、G04 和 G06 細菌多樣性較高, 分別是1 113、1 089 和880 種, 并且這3 個取樣點所處位置經度都較高; 由于采集時間和水樣采集深度相同, 因此菌群的多樣性可能與其經緯度及靠岸距離有關。本研究結果表明, 靠近岸邊的水域細菌豐富度降低, 這與Wang 等(2016)得出的污水及重金屬排放會對細菌群落造成一定影響的結果一致。

通過玉 玦圖分析, 我們以豐度相似度為指標, 6個取樣點可分為兩組, G09、G11 和G12 為第一組,G04、G06 和G08 為第二組, 并且第二組的細菌豐富度均高于第一組; G08 的物種豐富度最高, G11 與G08相比豐富度顯著降低, 多樣性減少; 隨后對這幾個取樣點的地理位置進行分析, 找到造成這種豐富度變化的可能原因是G08 所處位置遠離岸邊, 處于四周環海的位置, 菌群豐富度受到人為影響小, 群落結構較復雜; 而其他取樣點豐富度差距小的可能原因是所處位置相近, 周圍水生環境相近, 這與白潔等(2009)所得出的地域差異導致微生物群落結構和多樣性顯著不同的結果相一致。

本研究結果顯示, α-變形菌綱和γ-變形菌綱(弧菌科)在各海域中豐度較高, 這與之前虞嘉 玥等(2021)的研究結果一致; 其中γ-變形菌綱在G04 中最高, 在G12 中最低; 其次是α-變形菌綱。我們發現, 在維度較高的地方, γ-變形菌綱的流動性也在增強, 據文獻報道, γ-變形菌類群廣泛存在于是循環水健康養殖池及一些魚類的皮膚、腮、腸道中(Roeselerset al, 2011),且豐度越高越有利于養殖動物的健康生長(Huet al,2007; Schreieret al, 2010)。此外我們研究發現在海域中大多數的弧菌屬都來源于緯度最高的G04, 而弧菌屬多數屬于與魚病有關的病原菌或條件致病菌, 因此推測是隨著緯度的上升, 海域中γ-變形菌綱流動性在增高, 其他致病細菌豐度也在增加; 之后我們在對各取樣點細菌群落組成結構分析中, 得到在G09 中假交替單胞菌的豐度最高、弧菌豐度較低的結果; 在G04 中弧菌豐度最高, 假交替單胞菌最低, 這與楊行等(2019)研究得出的假交替單胞菌對弧菌的抑制作用有關結果一致。

α-變形菌綱中主要是紅細菌, 紅細菌科在經度較高的G11 和G06 中占比最高, 同時G11 和G06 中擬桿菌門和放線菌門的豐度在下降, 這些紅細菌能夠通過光合作用進行生長代謝, 涉及CO2和氮的固定的菌較多。在海洋生態系統的碳、氮循環中發揮重要作用(白潔等, 2009), 因此我們推測, 在G11 和G06的海水光照充足, 利于紅細菌進行光合作用, 所以紅細菌豐度變高; 同時也有研究表明變形菌門在土壤中的C、N 和S 循環中起著關鍵作用(Wanget al, 2020),而α-變形菌的相對豐度隨水體中總磷濃度增加而增加, 擬桿菌門的相對豐度隨磷酸鹽的濃度升高而增加(沈燕等, 2010)。擬桿菌門、放線菌門和γ-變形菌綱的豐度對水質變化敏感, 可用于指示和評價海水養殖污染的生態效應(Xionget al, 2014)。因此推測在G04、G11 和G06 取樣點周圍水環境污染相對嚴重一些, 可能由于其靠近海岸, 而人類活動是引起水體細菌群落結構變化的主要原因之一(虞嘉玥 等, 2021)。

通過對細菌種水平的分析, 我們發現大西洋美女神菌豐度在G04 取樣點中較高, 其次是在G11 中;該屬在結構組成上與海螺菌科的海螺菌屬非常接近,是一種典型的海洋細菌, 對鈉鹽有專性需求, 并且是一類有機物降解菌(G?rtneret al, 2008)。大西洋美女神菌在除G04 和G11 以外的其他取樣點中分布很少,同時G04 和G11 所處位置的緯度高于其他取樣點,且G04 略高于G11; 結合對PCA 圖的分析發現, G04的細菌組成與其他取樣點的細菌組成差異較大, 因此推測造成這種分布現象的可能原因是G04 的緯度、鈉鹽含量和有機物含量明顯高于其他5 個取樣點。柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)屬于黃桿菌科、黃桿菌屬, 廣泛存在于淡水、海水、土壤和植物中, 在世界范圍內的水體環境和土壤中均有分布, 可導致被感染魚類出現爛鰓、體表潰瘍等癥狀(張玉蕾等,2016)。在G12 中黃桿菌科豐度較高但弧菌豐度很低,在G04 中弧菌豐度較高, 但是黃桿菌豐度較低; 推測可能在經緯度都相對比較低的海域, 黃桿菌數量也隨之增多; 并且分析對比其他取樣點弧菌和黃桿菌的豐度變化情況推測, 黃桿菌和弧菌之間可能存在某種相互作用, 初步推測兩者之間可能存在拮抗作用。若要在該范圍水域進行養殖, 需先對黃桿菌數量進行處理, 否則可能會導致魚類死亡。

4 結論

綜上所述, 利用高通量測序對象山港海域6 個不同水域細菌的群落結構和多樣性進行分析比較, 發現變形菌門和藍細菌門是象山港水域3 月份的兩個優勢類群, 其次是放線菌門和厚壁菌門。推測在經緯度都相對比較低的海域黃桿菌數量增多, 黃桿菌和弧菌之間可能存在某種相互作用。后續可根據這一發現對細菌間的相互抑制作用進行深入研究; 并且本研究同時也進一步證明弧菌屬和假交替單胞菌屬之間的相互抑制作用, 可為象山港生物防治和水環境保護等提供參考。今后應考慮季節和人為因素, 有助于更深入了解不同生境下象山港細菌結構的變化規律。