綿羊MyoG基因內含子Ⅱ多態性及其與生長性狀的關聯分析

李靜云，王新樂，張云飛，白俊艷，2，李 淦，2，雷 瑩，2，董智豪，陳 宇，樊紅燈，王龍威，陳夢柯，王興科，司馬磊陽，張世文

（1.河南科技大學動物科技學院，洛陽 471023；2.洛陽市動物遺傳育種重點實驗室，洛陽 471023）

肌細胞生成素（myogenin，MyoG）基因是生肌調節因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族的一員，主要參與調控肌肉的生長[1]，誘導骨骼肌細胞的增殖、分化與融合[2]，以及調控骨骼肌的發育、成熟、損傷后的修復[3]。雞MRF4和MyoG基因共表達參與了骨骼肌細胞終末分化[4]。雖然MyoG基因在成年動物中表達量較低，但仍是調節骨骼肌有氧代謝和無氧代謝之間能量平衡的重要因素[5]。MyoG基因與生長性狀、胴體性狀和肉質性狀都有密切的關系[6-8]。Tepas等[9]研究表明，在梅山豬、荷蘭長白豬和杜洛克豬的MyoG基因中存在3個突變位點：梅山豬中檢測出突變位點1和2，荷蘭長白豬和杜洛克豬中檢測出突變位點2和3。王健等[10]對太湖鵝MyoG基因外顯子Ⅰ進行多態性分析，共發現HH、HI和II 3種基因型，且II基因型顯著影響太湖鵝的早期增重。郭琳等[11]研究表明，在三江黃牛Dickkopf蛋白家族成員（DKK1和DKK4）基因中各檢測到2個突變位點，但MyoG基因未檢測到多態位點。王瓊等[12]研究表明，在優質肉雞MyoG基因5′-調控區存在A、B 2個多態位點，與胸肌重、胸肌率、腿肌重及腿肌率均呈顯著相關。柴志欣等[13]研究顯示，牦牛MyoG基因中共發現T757C、G662A、A539G和A2216G 4個突變位點，均存在3種基因型；關聯分析表明，T757C、G662A、A539G位點與體高顯著相關。 彭邦星等[14]研究表明，興義鴨MyoG基因中共發現g.238 G>C、g.397 C>G、g.8 C>T、g.23 G>A、g.47 G>A、g.74 C>T及g.104 G>C 7個SNPs位點，其中g.238 G>C位點與胸肌率呈顯著關聯，g.8 C>T和g.104 G>C位點與全凈膛率呈顯著關聯，g.104 G>C位點與全凈膛重呈顯著關聯。綜上所述，MyoG基因對動物的生長、發育及繁殖有著重要作用。鑒于此，本研究以大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊5種綿羊為研究對象，利用PCR-RFLP技術對5個綿羊群體MyoG基因內含子Ⅱ的多態性進行分析，并分析了其與綿羊生長性狀的關聯性，以期為綿羊生長性狀相關的分子標記選擇提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和指標測定

選取河南省平頂山市寶豐縣農戶的大尾寒羊58只、河南省臺前縣農戶小尾寒羊52只、河南省洛陽市偃師區和伊川縣農戶的豫西脂尾羊36只、河南省洛陽市肉羊產業技術體系洛陽綜合試驗站湖羊34只、河南省洛陽市馬坡鎮鮮達牧業杜泊羊37只，共計試驗綿羊217只。頸靜脈采血10 mL，ACD抗凝處理（血液與ACD為5∶1（V/V）），置于冰盒中快速帶回實驗室，-20 ℃保存備用。

使用測杖、卷尺、電子秤等工具測定試驗綿羊的生長性狀指標：宰前活重、體高、體長、胸圍、胸寬、胸深、腰角寬、臀端寬、臀端高、管圍、背高、胴體重、尻高、尻長、頭長、頭深、頸長、額寬、腹圍及腿臀圍等，測定方法參考《家畜育種學》[15]。

1.2 主要試劑

全血基因組DNA試劑盒購自無錫百泰克生物技術有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、全血基因組蛋白酶K、限制性內切酶Eco72 Ⅰ均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；瓊脂糖購自上?；菖d生化試劑有限公司。

1.3 基因組DNA提取

取出綿羊血樣解凍后，根據DNA提取試劑盒說明書提取綿羊血液DNA，用超微量核酸濃度測定儀檢測DNA的濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。D260 nm/D280 nm值在1.65～1.85之間說明DNA樣品較好，根據DNA樣品純度和濃度將DNA稀釋至100 ng/μL，分裝至EP管中，-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計與合成

參考劉錚鑄等[16]設計MyoG基因內含子Ⅱ引物序列：F：5′-TCTTCCCTCTTCCCTTATTC-3′；R:5′-GTCCCTTGCTTTATCTCC-3′，預計擴增片段大小為908 bp。引物由鄭州鼎國生物技術有限公司合成。

1.5 PCR擴增

PCR擴增體系15 μL：上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，2×TaqPCR MasterMix 7.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共34個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取擴增產物5 μL經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察擴增結果，并拍照保存。

1.6 PCR-RFLP分析

酶切反應體系20 μL：PCR產物10 μL，10×Buffer 2 μL，Eco72 Ⅰ（10 000 U/mL） 0.2 μL，ddH2O 7.8 μL。在數顯恒溫水浴鍋中酶切3 h。取酶切產物5 μL經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察酶切分型結果，并拍照保存。

1.7 統計分析

利用PopGene32軟件整理計算MyoG基因內含子Ⅱ的基因型頻率、基因頻率及雜合度、多態信息含量、有效等位基因數等群體遺傳多態性。利用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）對MyoG基因內含子Ⅱ多態性與綿羊生長性狀進行關聯分析。分析模型如下：

yijk=μ+Si+Mj+Dk+eijk

式中，yijk為性狀表型值；μ為總體均值；Si為性別效應（i=1，2）；Mj為第j個基因型效應；Dk為第k個月齡效應（k=2、4、6、8、10、12）；eijk為殘差效應。

結果用平均值±標準差來表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 綿羊MyoG基因內含子Ⅱ的PCR擴增

綿羊MyoG基因內含子Ⅱ PCR擴增產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖1。 由圖1可知，電泳條帶清晰、單一無雜帶，片段長度約為908 bp，與目的片段大小相符，可滿足后續試驗要求。

1、2，大尾寒羊；3、4，小尾寒羊；5、6，豫西脂羊；7、8，杜泊羊；9、10，湖羊;M，DL2000 DNA Marker1 and 2，Large-tailed Han sheep；3 and 4，Small-tailed Han sheep；5 and 6，Yuxi Fat-tailed sheep；7 and 8，Dorper sheep；9 and 10，Hu sheep;M，DL2000 DNA Marker圖1 綿羊MyoG基因內含子ⅡPCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis detection of PCR products of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

2.2 綿羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP分析

大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、杜泊羊、湖羊MyoG基因內含子ⅡEco72 Ⅰ位點酶切分型結果見圖2～6。由圖2～6可知，酶切產物檢測到3種基因型：AA（368/540 bp）、AB（908/368/540 bp）及BB（908 bp），其中MyoG基因內含子ⅡEco72 Ⅰ位點在小尾寒羊、杜泊羊、湖羊群體中檢測到AA、AB、BB 3種基因型，而在大尾寒羊和豫西脂尾羊群體中僅檢測到AB和BB 2種基因型，沒有檢測到AA基因型。

1、2、4、5、7，AB基因型；3、6，BB基因型;M，DL2000 DNA Marker1，2，4，5 and 7，AB genotype；3 and 6，BB genotype;M，DL2000 DNA Marker圖2 大尾寒羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP結果Fig.2 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Large-tailed Han sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、4和6，AB基因型；2、3，AA基因型；5，BB基因型M，DL2000 DNA Marker；1，4 and 6，AB genotype；2 and 3，AA genotype；5，BB genotype圖3 小尾寒羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP結果Fig.3 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Small-tailed Han sheep

1～5、7～9，AB基因型；6，BB基因型;M，DL2000 DNA Marker1-5 and 7-9，AB genotype；6，AB genotype;M，DL2000 DNA Marker圖4 豫西脂尾羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP結果Fig.4 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Yuxi Fat-tailed sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、3、4和6，AB基因型；2、9，BB基因型；5、7和8，AA基因型M，DL2000 DNA Marker；1，3，4 and 6，AB genotype；2 and 9，BB genotype；5、7 and 8，AA genotype圖5 杜泊羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP結果Fig.5 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Dorper sheep

M，DL2000 DNA Marker；1、7和8，AA基因型；2、6：BB基因型；3～5，AB基因型M，DL2000 DNA Marker；1，7 and 8，AA genotype；2 and 6，BB genotype；3-5，AB genotype圖6 湖羊MyoG基因內含子Ⅱ Eco72 Ⅰ位點的PCR-RFLP結果Fig.6 PCR-RFLP results at Eco72 Ⅰ site of MyoG gene intron Ⅱ in Hu sheep

2.3 綿羊MyoG基因內含子Ⅱ的群體遺傳學分析

5個綿羊群體MyoG基因內含子Ⅱ的基因型頻率和基因頻率見表1。由表1可知，大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊、杜泊羊均以AB為主要基因型，基因型頻率分別為0.845、0.633、0.917、0.706及0.811，大尾寒羊和豫西脂尾羊未檢測到AA基因型；小尾寒羊和杜泊羊的A等位基因頻率分別為0.650和0.541，要高于B等位基因頻率；而大尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊的B等位基因頻率分別為0.575、0.542、0.529，要高于A等位基因頻率?？ǚ綑z驗發現，只有湖羊符合哈代-溫伯格平衡狀態（P>0.05），其他4種綿羊群體均顯著偏離哈代-溫伯格平衡狀態（P<0.05）。

表1 綿羊MyoG基因內含子Ⅱ的基因型頻率和基因頻率Table 1 Genotype frequency and gene frequency of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

5個綿羊群體MyoG基因內含子Ⅱ的群體遺傳學參數見表2。由表2可知，小尾寒羊的雜合度最低為0.455，杜泊羊的雜合度最高為0.497。5個綿羊群體中的有效等位基因數為1.835～1.992，多態信息含量（PIC）均為中度多態（0.25

表2 綿羊MyoG基因內含子Ⅱ的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of MyoG gene intron Ⅱ in sheep

2.4 MyoG基因內含子Ⅱ與綿羊生長性狀的關聯分析

由表3可知，綿羊MyoG基因內含子Ⅱ BB基因型個體胸圍、胸寬、頭長、頸長均顯著低于AA和AB基因型（P<0.05）；AA基因型個體宰前活重、體高、體長、臀端高、腰角寬、腿臀圍等性狀有高于BB基因型的趨勢，但差異均未達到顯著水平（P>0.05）。

表3 MyoG基因內含子Ⅱ與綿羊生長性狀的關聯分析Table 3 Association analysis between MyoG gene intron Ⅱ and growth traits in sheep

3 討 論

3.1 MyoG基因的多態性

隨著生活水平的提高，人們對于畜產品需求加大，通過傳統的飼料利用率、轉化能力來提高家畜生長速度、肉品質的方式已無法滿足當前的需要。生長性狀作為一項評定個體選育潛力的數量性狀，常常用于動物優良個體的早期選育過程中[17]。利用標記輔助選擇（marker assisted selection,MAS）可以篩選出與動物生長性狀相關的主效基因，能夠極大地提高低遺傳力性狀的選擇效率，加快人工育種速度，培育出遺傳性能穩定、性能良好的種畜[18]。目前，已有很多研究者對生長性狀相關基因的多態性進行了測定，并篩選出影響動物生長性狀的相關候選基因，如生長激素（GH）[19]、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）[20]、血管活性腸肽Ⅰ型受體（VIPR-1）[21]及生長激素促分泌素受體（GHSR）[22]等。

MyoG基因是動物生長發育過程的重要調節因子，對于動物的肌肉形成具有重要作用，因此，MyoG基因對生產性狀的影響也成為一個分子標記輔助選擇的研究熱點。脊椎動物的MyoG基因結構相似，包括3個外顯子和2個內含子[23]。劉永斌等[24]研究發現，MyoG基因外顯子1在4個綿羊品種中發現3種基因型：AA、BB和AB，但只有BB基因型在德國肉用美利奴羊中未檢測到。孫奴奴等[25]研究表明，MyoG基因在晉汾白豬和新山西黑豬中均檢測到AA、AB、BB 3種基因型，晉汾白豬的優勢基因型AA可用于人工選育出優秀豬種，而新山西黑豬則恰恰相反，其優勢基因型BB在人工選育時表現出更大的優勢。魏天等[26]研究顯示，在小尾寒羊MyoG基因外顯子1中發現1處突變位點C211T，經Chromas軟件比對分析發現3種基因型：AA、BB及AB，A等位基因頻率為0.706，屬于優勢等位基因。白俊艷等[27]研究發現，MyoG基因外顯子1在6個綿羊群體中存在3種基因型（AA、BB、AB）和2個等位基因（A、B）。姚毅等[28]研究顯示，在波爾山羊和成都麻羊MyoG基因內含子1中發現1個SNP位點C422T，存在3種基因型（AA、BB、AB）和2種等位基因（A、B）。劉錚鑄等[29]研究發現，波爾山羊MyoG基因由3個外顯子、2個內含子及部分5′-UTR（74 bp）和3′-UTR（260 bp）構成。韓銀倉等[30]研究顯示，MyoG基因外顯子Ⅰ上存在1個A109C的突變位點，該突變導致37位的谷氨酸（GAG）錯義突變為丙氨酸（GCG），經測序比對發現3種基因型：CC、CA及AA，其中CC為優勢基因型，C為優勢等位基因；河南縣歐拉型藏羊、祁連縣高原型藏羊群體均處于哈代-溫伯格平衡狀態，貴南縣黑藏羊群體處于哈代-溫伯格不平衡狀態。劉錚鑄等[16]研究發現，山羊MyoG基因內含子Ⅱ存在1個SNP位點C1823T，該位點有3種基因型：AA、AB和BB。儲明星等[31]研究發現，綿羊MyoG基因上有1處C183T突變，導致丙氨酸（GCC）錯義突變為纈氨酸（GTC）。

本試驗對大尾寒羊、小尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊和杜泊羊的MyoG基因內含子Ⅱ遺傳分析得到AA、AB和BB 3種基因型，這與劉錚鑄等[29]在波爾山羊和王瓊等[12]在雞MyoG基因內含子上分型結果一致，其中MyoG基因內含子Ⅱ在大尾寒羊、豫西脂尾羊、湖羊上的優勢基因為B，這與劉錚鑄等[29]在山羊上的試驗結果相同；而在大尾寒羊和豫西脂尾羊上未檢測到AA基因型，可能與試驗數據較少有關。 在5個綿羊群體中，只有湖羊MyoG基因內含子Ⅱ符合哈代-溫伯格平衡狀態，說明該群體遺傳受到了較少的人為和定向選擇。5個群體的多態信息含量均為中度多態，說明變異程度較高，選擇潛力相對較大。

3.2 MyoG基因與綿羊生產性狀的關聯分析

MyoG基因是影響動物產肉能力的主效基因[32]，在豬、牛、羊等上研究較多[33-35]，在禽類上多見于對肉品質的影響[36]。李云霞等[37]研究發現，在伊犁馬MyoG基因外顯子1中檢測出5個SNPs位點，其中SNP1（g.31187343 A>C）、SNP3（g.31187132 C>T）和SNP4（g.31197105 C>G）位點不同基因型對肉品質及肌纖維性狀有顯著影響。韋宏偉[38]在天府肉羊和成都麻羊MyoG基因內含子1上發現C/T突變，PCR-SSCP分型得到3種基因型：EE、EF、FF，不同基因型與體重顯著關聯。Bai等[39]研究表明，在肉用鵪鶉MyoG基因5′-UTR A、B位點發現AA、AB、BB 3種基因型，其中A位點與肉用鵪鶉肝臟重均呈顯著相關，B位點與體重、胴體重、胴體凈重、肝臟重量、胸肌重量和腿肌重量均呈顯著相關。孫偉等[40]研究發現，MyoG基因表達量隨湖羊日齡延長而增長，其基因表達水平與宰前活重、胴體重和凈肉重成正比。白俊艷等[27，41]研究發現，綿羊MyoG基因外顯子Ⅰ上存在AA、AB、BB 3種基因型，不同基因型與水分和色澤等肉質性狀顯著相關；在3個鵪鶉群體MyoG基因5′-UTR A位點發現AA、BB、AB、CC、AC、BC 6種基因型，且不同基因型與其體重、脛長、胸寬、胸深、胸骨長及體長等均呈顯著相關，在B位點檢測出AA、BB、CC、DD、EE、AB、AC、AD、AE 9種基因型，且不同基因型與其體重和脛長等生長性狀均呈顯著相關。本試驗結果表明，MyoG基因內含子Ⅱ的AA、AB基因型個體胸圍、胸寬、頭長、頸長均顯著高于BB基因型，與姚毅等[28]、柴志欣等[13]、白俊艷等[41]研究結果相似。MyoG基因在不同物種間具有不同的多態性，含有豐富的遺傳信息，不同的基因型影響不同的生長性狀，可能是因為堿基突變改變了氨基酸結構功能或改變基因的轉錄效率[42]。

4 結 論

5個綿羊群體MyoG基因內含子Ⅱ中存在3種基因型：AA（368/540 bp）、AB（908/368/540 bp）、BB（908 bp），優勢基因型均為AB基因型。關聯分析表明，該酶切位點與胸圍、胸寬、頭長、頸長等生長性狀均呈顯著相關。MyoG基因內含子Ⅱ的Eco72 Ⅰ位點可以作為影響綿羊生長性狀的分子標記。本研究結果可為今后綿羊生長性狀的分子標記輔助選擇提供參考價值。