雙酚A(BPA)對單環刺螠急性毒性及消化酶活力的影響*

丁子媛，劉 順，王思婕，陸 雯，亓 魯，朱 龍，許星鴻

(江蘇海洋大學 海洋科學與水產學院，江蘇 連云港 222005)

雙酚A(bisphenol A，BPA)屬于環境內分泌干擾物，為制作環氧和酚醛樹脂、聚碳酸酯塑料和食品漆涂料的基礎原料[1]。BPA高度的生殖毒性和風險效應使得其被歐盟列為應引起高度重視的化合物之一。盡管BPA具有毒性，但它仍被廣泛用于日常生活用品(包括紙張、水管、電子設備等)[2]，甚至出現在食品材料中(包括食品包裝袋、飲用水瓶、罐頭包裝涂層等)[3]，對人類具有致癌、增加糖尿病和心臟病的風險等危害[4]。目前有關BPA毒性的研究多集中在哺乳類、兩棲類和淡水水生生物等方面，如張石磊[5]發現低濃度BPA長期脅迫孕鼠導致其胚胎發育中斷，二代小鼠生殖器官發育異常；李圓圓等[6]研究發現BPA對黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)胚胎的96 h-LC50為7.68 mg/L，對蝌蚪的96 h-LC50為9.00 mg/L；周家輝等[7]報道BPA暴露可延遲稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)胚胎孵化，對仔魚的毒性效應表現為死亡率升高、心包囊水腫、心率下降及魚鰾充氣率下降。BPA主要通過工業廢水排放、垃圾滲濾液或其他化合物的自然降解進入水生態系統，進而對水生生物產生毒性作用，如抑制魚類繁殖、干擾魚類行為以及抑制藻類細胞分裂和光合作用等。BPA由于分布廣、難降解、易蓄積，其對海洋底棲動物比陸生動物具有更高的毒性。

單環刺螠(Urechisunicinctus)俗稱海腸，屬于螠蟲動物門(Echiura)、螠綱(Echiurida)、無管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠屬(Urechis)，主要分布于中國、朝鮮、俄羅斯和日本等海域潮間帶[8]。單環刺螠體壁肌肉味鮮美、富含蛋白質和不飽和脂肪酸，為消費者喜愛的海產品；其體腔液可提取纖溶酶、速激肽等藥用活性物質[9]，具有較大的開發利用價值。有關BPA對單環刺螠的毒性效應迄今尚未見報道。本文研究了BPA對單環刺螠的急性毒性及消化酶活力的影響，旨在為環境內分泌干擾物對海洋底棲生物的毒性效應研究提供數據參考，并可為海洋生態系統中環境內分泌干擾物的風險評價和漁業生物資源保護提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用單環刺螠購自江蘇省連云港市海寧中路水產品市場，平均體長為(11.5±1.3)cm，體質量為(19.8±3.5)g，于實驗室暫養7 d后進行實驗。暫養條件為：鹽度25，pH 8，水溫(15±1)℃，自然光照，連續充氣，日投喂2次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度1×106個/mL，投喂量10 mL/L。挑選體色鮮亮、大小均勻、活力較強的健康單環刺螠作為實驗對象。實驗用水為自來水和海水素配制成鹽度25的人工海水，經過濾曝氣充氧處理后使用。

1.2 試劑配制

因BPA在水中溶解度低，采用無水乙醇為助溶劑，配置成質量濃度為400 mg/L的母液，4 ℃避光保存。本研究所用BPA購自生工生物工程(上海)股份有限公司，為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗 采用半靜態水質接觸法(GB/T 27861—2011)進行急性毒性實驗[10]。根據BPA預實驗得出96 h無死亡發生的最高濃度和導致100%死亡的最低濃度，兩濃度間按照等對數間距設置7個質量濃度梯度：3.000，3.830，4.891，6.246，7.976，10.186和13.000 mg/L，另設海水空白組和無水乙醇溶劑組作為對照，溶劑組中無水乙醇含量與最高濃度組中無水乙醇含量相同。每組設置3個重復，每個重復隨機放置10條單環刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm養殖箱中飼養，養殖條件與暫養時相同，每24 h全量更換海水并維持各組BPA質量濃度，及時清除分泌物、排泄物以及死亡個體，實驗期間不投餌，以消除餌料影響。實驗共處理96 h，觀察形態特征變化，并記錄24，48，72和96 h的死亡個數。蟲體顏色發白、用玻璃棒觸碰時無明顯收縮反應即為死亡[11]。采用概率單位法計算出不同暴露時間的死亡率、半致死濃度LC50以及安全濃度SC(safe concentration)。SC=96 h×LC50×0.1[12]。根據96 h的LC50評定污染物的毒性等級[13]。

1.3.2 BPA對單環刺螠消化酶活力的影響 根據“1.3.1”急性毒性實驗所得BPA對單環刺螠的安全濃度以及BPA在水環境中的實際污染水平[1]，設置對照組和3個BPA濃度組：0.07，7，700 μg/L。每組設3個重復，每個重復隨機放置20條單環刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm養殖箱中飼養15 d，養殖條件與暫養時相同，每日全量更換海水并維持各組BPA質量濃度。在取材前一天停止投餌，以消除消化道內殘餌的影響。于實驗0.5，1，3，5，10和15 d，每組隨機取3條單環刺螠，置冰盤內解剖，取出消化道，放掉呼吸腸中水分，以100 g/L加入預冷蒸餾水，于冰浴中勻漿10 min。取部分勻漿液直接用于測定脂肪酶活力，其余勻漿液于10 000 r/min，1 ℃離心30 min。取上清液于-80 ℃保存，用于測定其他消化酶活力。蛋白酶活力測定采用福林—酚法，淀粉酶活力測定采用淀粉—碘顯色法，纖維素酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸顯色法[14]，脂肪酶活力測定采用NaOH滴定法[15]。酶液蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍G-250法，以牛血清蛋白為標準物進行測定。

蛋白酶活性單位定義為：在一定溫度和pH下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸作為1個酶活性單位(U)。淀粉酶活性單位定義為：在35 ℃下，30 min內，100 mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg為1個酶活性單位(U)。纖維素酶活性單位定義為：在pH 4.4，65 ℃下，1 min催化纖維素生成1 μg葡萄糖為1個酶活性單位(U)。脂肪酶活性單位定義為：1 mL酶液在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產生1 μmol的可滴定脂肪酸為1個酶活性單位(U)。各酶的活力均定義為：1 mg酶液蛋白所具有的酶活性單位數(U/mg)。

1.4 數據處理和評價方法

實驗結果以“平均數±標準差”表示，利用SPSS 22.0統計軟件進行單因子方差分析(One-Way ANOVA)，LSD(least significant difference)多重比較和Duncan氏檢驗，顯著水平設為0.05；并得出BPA對單環刺螠急性毒性效應的概率單位與濃度對數的回歸方程，以及48,72,96 h的LC50和95%置信區間。

2 結果

2.1 BPA對單環刺螠的急性毒性

單環刺螠接觸不同濃度BPA后活力均受到一定影響，暴露24 h各處理組未出現死亡，但體形變細長、活力下降并伴有輕微吐臟現象。隨暴露時間延長，單環刺螠體表粘液增多，體壁變薄、出現痤瘡，褶皺增多呈串珠狀；伸縮頻率下降，受外界刺激時應激減弱；死亡個體多表現為黑色淤血、癱軟漂浮，或呈現紅色腫脹、硬結下沉(見圖1)。

a 體形細長或體表褶皺呈串珠狀

暴露于不同濃度BPA后單環刺螠的死亡率結果見表1。無水乙醇溶劑組與海水空白組96 h內均無死亡，表明以無水乙醇作為助溶劑在個體水平對本實驗的毒性結果無影響。24 h各濃度組未出現死亡現象，隨著BPA濃度的升高和暴露時間的延長，單環刺螠死亡率逐漸上升，48 h高濃度組(質量濃度10.186 mg/L，13.000 mg/L)開始出現死亡，死亡率存在顯著差異(P<0.05)，13.000 mg/L濃度組96 h全部死亡。

表1 暴露于不同濃度BPA溶液后單環刺螠的死亡率

BPA對單環刺螠急性毒性效應的回歸統計結果見表2。在處理24 h內，各濃度組均未出現死亡，因此，24 h時BPA的LC50>13.000 mg/L。48，72，96 h時BPA的LC50(95%置信區間)分別為13.297 mg/L(12.455～14.993 mg/L)，10.487 mg/L(9.711～11.487 mg/L)，7.515 mg/L(7.000～8.098 mg/L)，BPA對單環刺螠的安全濃度SC為0.752 mg/L。根據BPA對單環刺螠急性毒性效應的概率單位與濃度對數的回歸方程，48，72，96 h的相關系數R2分別為0.981 2，0.970 4，0.954 4，表明單環刺螠在BPA中的死亡率與質量濃度之間存在顯著的相關性(P<0.05)，具有明顯的劑量—效應關系。根據GB 30000.28—2013《化學品分類和標簽規范 第28部分：對水生環境的危害》[13]對受試物的急性水環境毒性的分級標準(96 h的LC50≤1 mg/L為Ⅰ級，1 mg/L

表2 BPA對單環刺螠急性毒性效應的回歸統計

2.2 BPA對單環刺螠消化道消化酶活力的影響

2.2.1 BPA對蛋白酶活力的影響 BPA對單環刺螠消化道胃蛋白酶活力的影響如圖2所示。

圖2 BPA對單環刺螠消化道胃蛋白酶活力的影響

在BPA暴露下，低質量濃度0.07 μg/L組胃蛋白酶活力呈現明顯的誘導效應，處理0.5 d時升高至最大值(P<0.05)，但隨脅迫時間延長逐漸下降，至處理15 d與對照組相近；中質量濃度7 μg/L組胃蛋白酶活力在BPA脅迫下雖略有上升，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；高質量濃度700 μg/L組胃蛋白酶活力呈現波動的變化，處理0.5 d時即顯著低于對照組(P<0.05)，隨暴露時間延長有所回升后又逐漸下降，整體呈現抑制效應。

BPA對單環刺螠消化道胰蛋白酶活力的影響如圖3所示。

圖3 BPA對單環刺螠消化道胰蛋白酶活力的影響

BPA暴露的一定時間內，對單環刺螠胰蛋白酶活力呈現顯著的誘導效應。以高質量濃度700 μg/L組誘導最快，在處理0.5 d時胰蛋白酶活力即達到最大值，隨后逐漸下降。0.07 μg/L和7 μg/L兩組胰蛋白酶活力呈現先降后升再降的趨勢，分別于處理5 d和1 d達到最大值。至處理15 d，實驗組胰蛋白酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，且呈現一定的劑量—效應關系。

2.2.2 BPA對單環刺螠消化道淀粉酶活力的影響 BPA脅迫對單環刺螠消化道淀粉酶活力呈現明顯的抑制效應(見圖4)。脅迫0.5 d和1 d時，0.07 μg/L和7 μg/L質量濃度組淀粉酶活力與對照組差異不顯著，高質量濃度700 μg/L組淀粉酶活力顯著低于其他實驗組(P<0.05)。脅迫3 d時，各實驗組淀粉酶活力均顯著低于對照組，隨脅迫時間延長雖略有回升，但至處理15 d，各實驗組淀粉酶活力仍顯著低于對照組(P<0.05)。

圖4 BPA對單環刺螠消化道淀粉酶活力的影響

2.2.3 BPA對纖維素酶活力的影響 在BPA脅迫下，單環刺螠消化道纖維素酶活力呈現先降后升再降的變化趨勢(見圖5)。脅迫0.5 d和3 d，各實驗組纖維素酶活力均持續下降，但實驗組間差異不顯著(P>0.05)。處理5 d時，實驗組纖維素酶活力有所回升，但隨后又呈現出下降趨勢。至處理15 d時，各實驗組纖維素酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，脅迫濃度越高纖維素酶活力越低，呈現一定的劑量—效應關系。

圖5 BPA對單環刺螠消化道纖維素酶活力的影響

2.2.4 BPA對脂肪酶活力的影響 由圖6可見，BPA對單環刺螠消化道脂肪酶活力有顯著誘導作用。處理0.5 d時，各實驗組脂肪酶活力均顯著升高，以中質量濃度7 μg/L組誘導幅度最大。隨脅迫時間延長，各實驗組脂肪酶活力均呈現先降后升再降的趨勢，至處理10 d，低質量濃度0.07 μg/L組脂肪酶活力仍顯著高于對照組，但至處理15 d，各實驗組脂肪酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖6 BPA對單環刺螠消化道脂肪酶活力的影響

3 討論

3.1 BPA對單環刺螠的急性毒性

已有研究表明，BPA能對水生生物的生長發育產生毒性效應，導致畸形且行為異常等。李楠[16]報道高濃度BPA可導致斑馬魚(Barchydaniorerio)中毒，表現出側游、沉底以及反應遲鈍等中毒癥狀。牛海崗等[17]發現BPA使中國林蛙(Ranachensinensis)蝌蚪身體蜷縮、黏液增多、游泳速度減慢并失去平衡，高濃度BPA會導致林蛙蝌蚪死亡。本研究中，在BPA暴露下，單環刺螠體形變得細長、伸縮頻繁，隨著暴露時間延長，其活力降低，伸縮頻率下降，受外界刺激時反應遲鈍，身體僵硬，體表潰爛甚至癱軟死亡，與重金屬鎘[18]和鹽度等脅迫[19]下單環刺螠的表現一致，屬于外界環境變化時的機體應激反應。

單環刺螠的死亡率與BPA濃度呈正相關，并具有一定的時間—效應關系。24 h內各濃度組均未出現死亡，表明單環刺螠對短時間內較高濃度BPA暴露具有一定的耐受能力。但隨暴露時間的延長，各實驗組死亡率上升，96 h時13.000 mg/L質量濃度組單環刺螠全部死亡。BPA對單環刺螠48,72,96 h的LC50分別為13.297,10.487和7.515 mg/L，具有明顯的劑量—效應關系。根據GB 30000.28—2013的分級標準，BPA對單環刺螠的毒性為Ⅱ級。BPA對日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦24,48 h的LC50分別為25.68,12.03 mg/L[20]；對稀有鮈鯽胚胎和仔魚的96 h LC50分別為10.096,4.237 mg/L[7]；對明線瓶螺(Pomacealineata)成體48,96 h的LC50分別為22.80,11.09 mg/L[21]；對河蜆(Corbiculafluminea)96 h的LC50為6.34 mg/L[22]；對東亞三角渦蟲(Dugesiajaponica)48,72 h的LC50分別為8.49,6.43 mg/L[23]。由此可見，單環刺螠對BPA的耐受能力高于河蜆和東亞三角渦蟲，而低于明線瓶螺。關于BPA對海洋底棲動物的毒性效應研究文獻非常有限，需要進一步積累該領域基礎資料。

深圳市近海海域海水中BPA污染質量濃度在3.2～776.6 ng/L的范圍內[24]，渤海南部海域與國內部分海域相比BPA質量濃度較低，范圍為1.5～275 ng/L[25]，新加坡近海部分區域(如樟宜、實龍崗)BPA質量濃度達500 ng/L[26]。本研究結果表明BPA對單環刺螠的安全濃度為0.752 mg/L，雖遠高于目前海水中所檢測的BPA含量，但可通過食物鏈造成的富集效應對生物尤其是底棲動物帶來一定的危害，其潛在的生態風險不可忽視。

3.2 BPA對單環刺螠消化道消化酶活力的影響

單環刺螠的生長發育依賴養分的攝入，與單環刺螠消化道中的消化酶密切相關。消化酶是具有促消化功能的蛋白質，參與機體能量轉化，可分為蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶等，是評估毒理效應的有效參數[27]。因此，研究BPA對單環刺螠消化酶活力的影響，對人工養殖水質調控及海域水環境污染物危險評估具有重要意義。

在本研究中，短時間、低質量濃度的BPA脅迫可誘導單環刺螠蛋白酶和脂肪酶活力，但隨脅迫時間延長和質量濃度增加，酶活力受到抑制。在內分泌干擾物PBDEs對褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)消化酶的影響[28]、重金屬(Cu2+,Zn2+)對日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)幼蝦消化酶活力的影響[29]以及苯酚脅迫下多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)腸道消化酶活力的變化[30]等研究中均得到了與本研究類似的“低促高抑”效應。這種“低促高抑”效應在早在19世紀就已被學者發現，又稱Hormesis效應[31]。單環刺螠機體內環境穩態受低濃度BPA的干擾，啟動應激反應，通過提高其消化酶活力能夠供給較多的能量，以維持正常的生理代謝，但隨著脅迫濃度的增大和脅迫時間的延長，超過了其耐受能力，消化酶活力亦受到抑制。

本研究結果顯示BPA對淀粉酶和纖維素酶活力具有顯著的抑制效應，與王書揚等[18]關于鎘脅迫下單環刺螠體腔液淀粉酶的活力顯著下降的報道相一致。毛姍姍[32]發現植物雌激素——金雀異黃素能顯著降低金魚(CarassiusauratusLinnaeus)肝臟及腸道淀粉酶、蛋白酶的活性。BPA被認為是一種類雌激素和內分泌干擾物，對斑馬魚胚胎發育具有生殖毒性[33]；BPA能通過損傷胰島素信號通路、誘導代謝重編程、改變DNA甲基轉移酶的表達、誘導組蛋白修飾并改變miRNA的表達等途徑以及損傷抗氧化系統導致機體代謝紊亂[34]。Wang等[35]報道BPA對小鼠表現出強烈的腸道毒性，可引起腸道屏障功能障礙。單環刺螠為濾食性，以藻類和有機碎屑為食[36-37]，其食物富含植物多糖和纖維素，因此淀粉酶和纖維素酶活力處于較高水平。BPA脅迫可造成單環刺螠淀粉酶和纖維素酶活力迅速下降，表明BPA對其消化能力影響較大。關于BPA對單環刺螠消化機能影響的機制有待進一步研究。