基于ADH3基因的野生大麥系統進化分析

王夢薇，周羽，王樹杰，沈輝，任喜峰

1.華中農業大學植物科學技術學院，武漢 430070；2.河南省駐馬店市農業科學院，駐馬店 463000；3.湖北省襄陽市原種繁殖場，襄陽 441004

大麥是世界上最早被馴化的作物［1］。因其具有早熟、豐產、抗逆性強和適應性廣等優點，成為世界廣泛栽培的作物之一［2］。野生大麥作為栽培大麥的祖先，其在長期自然選擇過程中，積累了大量抗病蟲害、抗旱、耐鹽、耐貧瘠等優良基因［3］，是大麥進行遺傳育種和品種改良的重要基因資源［2］。然而，野生大麥的系統演化機制尚存在很大的分歧，一些研究者認為近東新月沃地是大麥的唯一起源地［1，4-9］，也有學者支持近東、中國西藏、中亞、埃及、利比亞和埃塞俄比亞等大麥多起源理論［10-15］。目前，大量的分子證據證實，除了近東新月沃地，中亞和中國西藏是大麥的潛在馴化中心［12，15-16］。也有學者證實西藏是大麥的多樣性中心而非起源中心，因為找不到野生群落的存在，西藏野生大麥實際上是以雜草的形式存在于田埂的半野生大麥［6］。另據報道，西藏的大麥是近東野生大麥向東擴散到中亞后，繼續向東由巴基斯坦、印度擴散到中國西藏［1，6］，也有學者認為西藏大麥是由近東通過青藏高原以北地區進入東亞，再到達東南部青藏高原［17-18］。

隨著分子生物學的發展，利用基因和基因組重測序等分子手段可更高效地研究大麥的進化及馴化，乙醇脫氫酶基因（ADH）具有催化乙醇分解的生物學功能，在禾本科植物遺傳研究中被廣泛應用，研究表明該基因在大麥中含有3 個拷貝［19］；乙醇脫氫酶Ⅲ基因（ADH3）可揭示大麥種群的地理分布格局，也可用于檢測大麥屬植物在進化中曾發生的重組和漸滲事件［20］。本研究基于ADH3基因對91份來自近東、中亞和中國西藏的野生大麥進行系統進化分析，明確不同地理區域野生大麥的遺傳進化關系，旨在為研究栽培大麥的起源提供參考，為野生大麥的優異種質資源的收集和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗材料為91份野生大麥，按地理來源分為3個群體，其中近東野生大麥48份，西藏野生大麥20份，中亞野生大麥23份（表1）。這些野生大麥種質資源均由華中農業大學麥作課題組提供。所有材料種植于華中農業大學校內試驗田，每份材料1 行，行長1.5 m，行距20 cm。每份材料在3 葉期取10 株葉片混樣提取DNA。

表1 91份野生大麥種質信息Table 1 91 germplasm information of wild barley

1.2 DNA擴增和測序

乙醇脫氫酶Ⅲ基因（ADH3）的引物設計和PCR擴增均按Lin 等［19］的方法，該基因擴增片段為810 bp，PCR 產物經QIAquickTM PCR 純化試劑盒（Qiagen 公司）進行純化后，送泰和生物技術有限公司進行Sanger 測序。為了提高測序數據質量，每個樣本獨立擴增3 次并測序，且正向和反向鏈均獨立測序，分析序列長度為736 bp。

1.3 數據分析

用軟件MAFFT 對序列進行比對，將比對后的nex 格式文件導入 PAUP4 中，再從 Modeltest 軟件中選56個模型放入PAUP4中搜索最佳模型，根據最佳模型運用MrBayes 軟件構建系統發育樹。一直增加‘mcmc ngen’的值，使其達到30 000 000，此時的‘average standard deviation of split frequencies’小 于0.01，即已構建出能收斂的系統發育樹。之后將‘sump burnin’與‘sumt burnin=’均設置為500，構建出的共識樹最后利用Treeview 軟件進行可視化；使用STRUCTURE v.2.3.4軟件進行群體結構分析；在混合模型下，首先對K從2到4分別進行10次獨立模擬運算，每次模擬進行500 000 次預迭代（length of burn-in period）和1 000 000 次基于馬爾可夫鏈蒙特卡羅迭代（Markov Chain Monte Carlo，MCMC）。之后利用Structure Harvester與Clumpak對群體結構的結果計算后驗概率值（LnP（D））以及K為2～4 時計算每份種質的遺傳成分。對比后的序列用DnaSP6軟件進行單倍型分析，最后在PopART 軟件中制作單倍型網絡圖。

2 結果與分析

2.1 野生大麥ADH3基因序列的遺傳分析

將本研究的91份不同來源野生大麥材料基于ADH3基因序列的多態性位點數（S）、單倍型個數（H）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸多樣性（π）以及沃特森估計值（θW）等指標進行遺傳差異分析（表2）。結果顯示，3 個不同來源野生大麥群體的核苷酸多態性突變位點總數為48 個，其中近東野生大麥具有最多的多態性位點個數（S=46），幾乎涵蓋了所有多態性位點數；而中亞與西藏野生大麥的多態性位點數量較少，分別為35 個和31 個。從單倍型個數看，3 個野生大麥群體總的單倍型個數為26，近東野生大麥的單倍型個數最多（H=22），中亞與西藏野生大麥的單倍型個數分別為8 和5。從單倍型多樣性看，近東野生大麥群體的單倍型多樣性最高，為0.914；而中亞與西藏野生大麥的單倍型多樣性較低，分別為0.810 和0.753。從核苷酸多樣性看，近東野生大麥群體的π值最高，為0.012 65±0.002 47；其次是西藏野生大麥，為0.012 16±0.004 38；中亞野生大麥最低，為0.011 10±0.004 19。從沃特森估計值結果看，近東野生大麥θW值最高，為0.014 40；而西藏野生大麥的θW值最低，為0.012 14。綜上，近東野生大麥的多態性位點數、單倍型個數及遺傳多樣性均遠高于中亞和西藏野生大麥。

表2 野生大麥ADH3基因的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of ADH3 gene in wild barley

2.2 野生大麥ADH3基因序列的系統進化分析

為了研究3 個不同來源野生大麥群體單倍型之間的關聯性，對26 個不同的單倍型進行關聯分析（圖1）。結果顯示，3 個群體的不同單倍型以近東和西藏野生大麥共有的單倍型Hap9 為一個大的多樣性中心點，向周圍進行點狀發散，推斷Hap9 可能是一個古老單倍型。其次是近東和中亞野生大麥共有的單倍型Hap1 和3 個地區野生大麥共有的單倍型Hap10也各自形成一個小的多樣性中心。此外，近東野生大麥存在特有的單倍型共15 個，而中亞和西藏野生大麥特有的單倍型分別只有2 個（Hap3 和Hap5）和1 個（Hap24）。這更進一步奠定了近東作為大麥起源中心的地位，同時，由于中亞和西藏獨特的地理環境增加了新的單倍型出現。另外，近東野生大麥與西藏野生大麥群體的單倍型相距較近，推測西藏野生大麥可能來源于近東野生大麥。

圖1 野生大麥ADH3基因序列的單倍型網絡Fig.1 Haplotype network of ADH3 gene sequences in wild barley

為進一步探究3 個不同野生大麥群體之間的遺傳進化關系，基于ADH3基因序列對91份不同來源野生大麥材料構建遺傳進化樹（圖2）。結果顯示，91份不同來源野生大麥材料主要被分成2 個大的類群（Ⅰ和Ⅱ），每個類群又分成3～4 個亞群。且81%的近東野生大麥和80%的西藏野生大麥聚類于Ⅰ類群，91%的中亞野生大麥與少部分近東和西藏野生大麥混合聚類于Ⅱ類群，從各材料間進化樹的聚類情況來看，ADH3基因在野生大麥的種系發育上存在較明顯的分化。其中，近東野生大麥與西藏野生大麥的親緣關系更近，而中亞野生大麥與西藏野生大麥的親緣關系更遠。

2.3 群體結構分析

群體結構分析有助于進一步明確不同地理區域野生大麥之間的遺傳進化關系，對91份野生大麥的SNP 進行群體結構分析（圖3）。設置其群體結構值（K值）為2～4，當K=2 時，91份野生大麥被分為紅色和藍色2個亞群，其中近東和西藏野生大麥以藍色亞群為主，中亞野生大麥以紅色亞群為主；當K=3時，91份野生大麥被分為紅色、藍色和綠色3個亞群，近東野生大麥和西藏野生大麥種質仍以藍色亞群為主，同時增加了大量綠色亞群的成分，中亞野生大麥仍以紅色亞群為主；當K=4 時，91份野生大麥被分為紅色、藍色、綠色和黃色4個亞群，近東野生大麥和西藏野生大麥仍保持相似的群體結構，而中亞野生大麥仍以紅色亞群為主。這說明一方面西藏野生大麥的遺傳成分與近東野生大麥相近，與系統進化分析得到的結果相一致（圖1，2）；另一方面也可能是西藏野生大麥和近東野生大麥之間存在互相傳播導致基因交流的可能。

圖3 野生大麥群體的群體結構（K=2、3、4）Fig.3 Population structure of wild barley populations（K=2，3，4）

3 討 論

大麥在馴化過程中會經歷遺傳瓶頸［21-22］和人為干擾［23］等現象，致使其丟失大量的遺傳多樣性［24］，而起源地的野生大麥群體通常表現出較高的遺傳多樣性［25］。本研究對91份不同來源的野生大麥基于ADH3基因序列的遺傳差異分析結果表明，近東野生大麥不僅具有最多的多態性位點個數（S=46）和單倍型個數（H=22），而且近東野生大麥群體的單倍型多樣性（Hd=0.914）和核苷酸多樣性（π=0.012 65±0.002 47）均明顯高于中亞與西藏野生大麥。推測近東野生大麥是栽培大麥的起源中心，而中亞和西藏野生大麥可能是由近東野生大麥擴散后形成的新的多樣性馴化中心，所得結論支持近東單起源假說［1，4-9］。

其次，進化和群體結構分析的結果表明3個群體的不同單倍型以近東和西藏野生大麥共有的單倍型Hap9 為中心形成一個大的多樣性中心點，且81%的近東野生大麥和80%的西藏野生大麥聚類于Ⅰ類群，91%的中亞大麥與少部分近東和西藏野生大麥混合聚類于Ⅱ類群。群體結構分析也表明西藏野生大麥的遺傳成分與近東野生大麥非常相近，表明近東野生大麥和西藏野生大麥群體之間有更近的親緣關系。推測可能是西藏野生大麥和近東野生大麥之間存在互相傳播導致基因交流的可能。這不同于大多數學者認為的近東野生大麥先擴散到中亞后，繼續向東由巴基斯坦、印度擴散到中國西藏的路徑［1，6］，而支持由考古證實的西藏大麥是由近東通過青藏高原以北地區進入東亞，再到達東南部青藏高原的傳播途徑［17-18］。

本研究通過對不同來源野生大麥材料進行遺傳進化分析，有助于進一步了解野生大麥的遺傳多樣性和群體結構，明確3 個潛在的大麥起源地近東、西藏、中亞野生大麥的遺傳進化關系，可為探究大麥的起源提供分子依據，為大麥育種家對種質資源收集、抗性遺傳改良等方面的育種工作打下基礎。