犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠銀屑病模型IL-23/IL-17/IL-22軸的作用機制研究

周學麗、袁世清、李春霄、左小紅、吳軍、萬鵬，

銀屑病是一種常見的以表皮角化不全、白細胞浸潤、真皮毛細血管擴張為特征的慢性遺傳性炎癥性疾病[1]。全世界各地均有銀屑病病例發生，其患病率為2-3%[2]，甚至高達4.8%[3]，其中20%患者已發展為重度銀屑病，并伴有高風險的非皮膚癌證[4]。銀屑病的發病機制非常復雜，被認為與先天和獲得性免疫反應、遺傳因素、環境因素和代謝紊亂等多種因素有關。其中，L-23/IL-17/IL-22軸是誘發銀屑病患者皮膚炎性細胞大量浸潤和表皮過度增生的主要誘因[5]。

銀屑病的傳統治療手段很多，但其療效卻并不令人滿意。外用藥物和光療或全身藥物的組合已經被很好地確定為影響大面積的中到重度銀屑病的治療方案[6]，然而仍然需要新的方法和藥物來提高治療效果[7]。傳統中醫藥在治療銀屑病方面積累了豐富的經驗，犀角地黃湯作為治療銀屑病的常用經典方藥之一，其良好的臨床療效已被越來越多研究所證實[8-10]。本研究采用犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的銀屑病模型小鼠進行干預，通過系統觀察和分析小鼠皮損的臨床與組織病理學改變、血清中與L-23/IL-17/IL-22軸相關的炎癥因子的表達情況等，以期探索犀角地黃湯治療銀屑病的療效機制，從而為銀屑病的中醫藥臨床防治提供有效經驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 BALB/c小鼠，SPF級，體質量18～22g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2020-030。

1.1.2 實驗藥物 犀角地黃湯藥物組成：水牛角30 g，生地30 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g。制備方法：稱取各藥材，用水煎煮制備，共煎煮2次，煎出液合并，濃縮到每劑藥85 ml。犀角地黃湯的人體推薦攝入量為85 g/d生藥，相當于1.42 g﹒kg-1﹒d-1生藥（成人以60 kg計）。

1.1.3 主要試劑 甲氨蝶呤片（珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司，國藥準字H20040283），5%咪喹莫特乳膏（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020644）。白細胞介素‐1β（ⅠL‐1β）、白細胞介素-17（IL-17A）、白細胞介素-22（IL-22）、白細胞介素-23（IL-23）、腫瘤壞死因子‐α（TNF‐α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；其余常規試劑均為分析純。

1.1.4 主要儀器 酶標儀DENLEY DR AGON Wellscan MK 3（Thermo），洗板機Wellwash 4 MK2（Thermo），數字顯示隔水式電熱恒溫培養箱PYX-DHS（上海躍進醫療器械廠），離心機TGL-16B（上海安亭科學儀器廠），移液槍Thermo labsystems、漩渦混合器XW-80A（上海青浦滬西儀器廠），電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9023A（上海精宏實驗設備有限公司），連續分液器（TOMOS LIFE SCIENCE Group），高通量組織研磨器（寧波新芝）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備及給藥方法 將60只BALB/c小鼠隨機分為6組，每組10只，即：正常組、模型組、甲氨蝶呤（2 mg﹒kg-1﹒d-1）對照組、犀角地黃湯低（8.7 g﹒kg-1﹒d-1）、中（17.4 g﹒kg-1﹒d-1，相當于臨床等效劑量）、高（34.8 g﹒kg-1﹒d-1）劑量組。以戊巴比妥鈉（36 mg/kg）經腹腔注射麻醉后，進行小鼠背部脫毛，面積2×3cm，休息3天后開始實驗。

除正常組涂抹凡士林外，其余各組每日在小鼠裸露背部涂抹5%咪喹莫特（IMQ）乳膏，劑量為62.5 mg，每日1次。間隔4小時后，各組給予相應藥物灌胃，每日2次，連續8天?？瞻捉M和模型組給與等量的生理鹽水。

1.2.2 PASI評分 依據銀屑病皮損嚴重程度指數（PASI）評分標準，每日照相記錄和評價小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤程度的情況積分。三項癥狀評分分別為0-4分。其中0：無癥狀；1：輕度；2：中度；3：重度；4：極其嚴重。三者評分之和為總評分，0-12分，總評分越高表示皮損越嚴重。

1.2.3 皮損取材 各組小鼠于給藥8 d后取材，摘雙側眼球取血，同時按照九格法剪取各組相對應皮損處組織保存待用。最后采用戊巴比妥鈉（36 mg/kg）腹腔注射麻醉處死小鼠。

1.2.4 蘇木精-伊紅（HE） 取出小鼠背部皮膚組織后進行酒精梯度脫水，二甲苯透明，用石蠟包埋后制備切片。使用蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察表皮變化。

1.2.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA法）檢測對各組小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎性細胞因子進行定量分析，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 統計學處理 實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，采用IBM SPSS26.0和Graphpad Prism8.0軟件進行統計分析。同一時間多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較用LSD法，檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 犀角地黃湯對IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損的影響

根據PASI評分標準，實驗第3天起，模型組小鼠背部皮膚開始出現紅斑、鱗屑等皮損，其程度隨實驗進行而逐漸加重，至第8天最為嚴重，表現為大面積紅斑、被覆鱗屑、明顯浸潤等。與模型組比較，正常組皮膚無明顯變化，甲氨蝶呤組紅斑和鱗屑等銀屑病樣癥狀均明顯減輕，犀角地黃湯各劑量組表現出與甲氨蝶呤組相同的發展趨勢。PASI評分顯示，除正常組外，其余各組分值均逐日有不同程度的增加；與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組與甲氨蝶呤組評分均有所降低，其PASI總分自第3天起差異開始具有統計學意義（F=3.107，P＜0.05）。提示犀角地黃湯在該模型中具有抑制銀屑病樣皮損產生的作用（見圖1、圖2）。

2.2 犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損組織學的影響

HE染色結果顯示（見圖3），正常組、模型組、甲氨蝶呤組和犀角地黃湯低、中、高劑量組的皮膚組織狀態具有明顯差異。與正常組比較，模型組可見表皮角化過度及融合性角化不全，顆粒層增厚，牟羅微膿腫，真皮淺層炎癥細胞浸潤，真皮血管擴張，扭曲、充盈，表皮散在中性粒細胞浸潤，呈銀屑病型增生，提示造模成功。與甲氨蝶呤組效果相近，犀角地黃湯高、中劑量組明顯改善IMQ誘導的銀屑病樣皮損。

2.3 犀角地黃湯對咪喹莫特誘導的銀屑病小鼠血清中IL-23/IL-17/IL-22軸等相關炎性細胞因子表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠的血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α均大量表達。與模型組相比，甲氨蝶呤組和犀角地黃湯各劑量組均顯著抑制了ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α炎性細胞因子的過量表達（P＜0.05），差異有統計學意義。但與甲氨蝶呤組相比，犀角地黃湯各組的抑制作用相近（P＞0.05），低、中、高劑量組之間作用亦相近（P＞0.05），差異無統計學意義（見圖4）。

3 討論

銀屑病是一種T細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，病理特征主要為表皮角質形成細胞過度增殖和異常分化[11,12]，臨床以紅斑和銀白色鱗屑為主要表現。2008 年我國開展的一次大規模銀屑病流行病學調查[13]發現，我國銀屑病標化患病率為0.47%，提示我國銀屑病患病率呈現上升趨勢。由于銀屑病病因復雜、病程長、易復發，常給病人帶來生理、心理、社會等多方面的不良影響，嚴重影響病人的生活質量[14]。然而，銀屑病的臨床治療難度較大，部分治療方案不僅效果欠佳，還可導致嚴重的不良反應[15]。不僅如此，銀屑病的治療費用還頗為昂貴，根據美國全美銀屑病基金會的數據顯示，每年直接和間接用于銀屑病的費用已經超過了110億美元[16]，其中尤以生物療法最為昂貴[17]。因此，為了篩選出療效優良、副作用小、費用低廉的治療藥物，有必要進一步開展傳統中醫藥防治銀屑病的相關機制研究。本研究采用咪喹莫特誘導成功建立了銀屑病小鼠模型。根據PASI評分和HE染色結果發現，與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組紅斑、鱗屑、浸潤等銀屑病樣癥狀均明顯減輕，與甲氨蝶呤組效果相近，提示犀角地黃湯在該模型中具有抑制銀屑病樣癥狀產生的作用。

以往的研究已經發現，銀屑病皮損中Th17細胞數量增加，IL-17A、IL-22、IL-23等細胞因子水平升高，在銀屑病發病機制中起主要作用[18-20]。IL-17能誘導角質形成細胞表達趨化因子如CCL20、CXCL1等[21,22]，它們可以招募更多的炎癥細胞到達銀屑病的皮膚病灶。同時，這些炎癥細胞或者角質形成細胞又能產生TNF‐α、ⅠL‐1β、IL-6等細胞因子，反過來刺激樹突狀細胞產生IL-23，從而形成一個炎癥應答級聯放大的循環體系[23]。此外，角質形成細胞還具有細胞因子受體，可作為活化的T淋巴細胞來源的IL-17和IL-22的靶標，從而促進角質形成細胞的增殖、異常分化和進一步產生細胞因子[24]。本研究小組通過ELISA法檢測各組小鼠血清中ⅠL‐1β、IL-17A、IL-22、IL-23 和TNF‐α等炎癥因子含量，結果提示，與模型組比較，犀角地黃湯各劑量組可以降低銀屑病樣小鼠上述炎癥因子的表達。

綜上所述，作為中醫藥涼血消斑法的代表方劑，犀角地黃湯可以改善咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損，其機制可能與降低L-23/IL-17/IL-22軸相關炎性細胞因子，從而發揮抗炎功能有關。