雄性大鼠原發性早泄模型的建立與評估

敦鑫龍，張 磊，高 明，陳 濤，鄭萬祥，魏 迪，鞠東恩，侯廣東，陸 軍，孟 平，袁建林

(1.空軍軍醫大學西京醫院泌尿外科，陜西西安 710032；2.延安大學附屬西安大興醫院泌尿外科，陜西西安 710016；3.空軍軍醫大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學教研室，陜西西安 710032)

早泄(premature ejaculation, PE)是臨床最常見的男性性功能障礙疾病之一，最新的國內研究表明，PE患病率約為32%[1]。PE對于患者自身、家庭以及社會都有極大的負面影響。近年來隨著社會發展、人民生活水平日益改善，人們對性生活的要求逐漸提高，對PE的治療需求也逐漸增加。

目前在PE的基礎研究中，建模方式主要有藥物法[2]、電擊法[3]以及交配篩選法[4]。其中交配篩選模型篩選出的PE大鼠，更接近于臨床PE患者特點，越來越多地被運用于早泄機制研究中[5]。然而，目前基于射精頻率(ejaculation frequency，EF)的交配篩選模型存在一些不足：例如相較于射精潛伏期(ejaculation latency，EL)，EF與早泄患者陰道內射精潛伏期(intravaginal ejaculatory latency time，IELT)的關聯性較弱；再者，根據EF建立原發性早泄模型無法排除射精后間隔(post-ejaculatory interval, PEI)的影響，造成誤差等。

本研究基于WALDINGER等[6-8]提出的射精分布理論，進行雌雄大鼠交配實驗，依據EL建立原發性PE大鼠模型，并探究其可行性及優勢，以期為早泄的相關研究提供更穩定可靠的工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性Wistar大鼠84只、雌性50只，均為11周齡，SPF級。Wistar大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，并且飼養在空軍軍醫大學第三附屬醫院實驗動物中心SPF級屏障內，溫度和濕度環境適宜[8∶00-20∶00光照，20∶00-次日8∶00黑暗，40%～50%濕度，(22±2)℃室溫]，飲水和攝食自由。實驗前適應性飼養至少1周。

1.2 藥品和儀器黃體酮注射液(10 mg/1 mL，杭州動物藥品廠)、苯甲酸雌二醇注射液(4 mg/2 mL，杭州動物藥品廠)，玉米油(R10106睿思科生物技術有限公司)，紅外影像系統(浙江大華技術股份有限公司)，(50×40×30)cm3觀察籠，常規外科手術器械一套。

1.3 動物的處理

1.3.1雌鼠去勢手術 手術器械常規消毒，用7%的水合氯醛(0.4 mL/100 g)對雌鼠進行腹腔麻醉。雌鼠俯臥位，在脊柱兩側，兩肋下緣與大腿根部之間，用剪刀剪去毛發后用碘伏消毒?？v向切開約1 cm的切口，分離皮膚與皮下組織，切開肌肉層約0.5 cm，打開腹腔，用鑷子夾出脂肪組織。在脂肪組織中找到半徑約為0.4 cm的粉紅色卵巢(圖1)。沿卵巢根部結扎脂肪組織后切除卵巢，將剩余組織放回腹腔后，逐層縫合肌肉層、皮下組織及皮膚，在創口涂抹紅霉素軟膏以防感染。對側卵巢按照同樣的步驟進行切除。術后注射50 000 U青霉素預防感染。放入恒溫復蘇箱中等待復蘇。雌鼠術后恢復約2周。

圖1 雌鼠去勢手術中的卵巢

1.3.2雌性大鼠激素誘導發情 為了進行統一集中的交配實驗，需要雌鼠同步發情。我們采用雌孕激素皮下注射的方式進行誘導[9]。分別在交配實驗前48 h和4 h，對雌鼠頸部皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.05 mL(玉米油溶解，0.4 mg/mL)及黃體酮注射液0.05 mL(玉米油溶解，10 mg/mL)。

1.3.3雄鼠交配行為的習得 在正式交配實驗前1周，雄性大鼠與激素誘導發情的雌性大鼠1∶1合籠1晚，以加快大鼠對于性行為的適應和學習。

1.3.4大鼠交配的行為學實驗 行為學實驗時間為21∶00-次日1∶00，在黑暗的環境下進行，每只大鼠每周1次，共6次，記錄后3周數據。實驗步驟：關閉燈光，打開紅外影像系統，將1只雄鼠放入觀察籠中，適應5 min后，隨機挑選1只激素誘導的雌鼠加入，記錄1 h內的交配過程。交配實驗后，回放錄像，分析以下指標。騎跨潛伏期(mount latency, ML):從雌鼠放入到雄鼠第1次前肢爬高到雌鼠背部的時間(若第1次騎跨即插入，則騎跨和插入潛伏期一致)；插入潛伏期(intromission latency, IL):從雌鼠放入到雄鼠第1次插入陰道的時間；EL：從雄鼠第1次插入到第1次射精的時間(射精時刻以雄鼠身體劇烈抖動為準)；騎跨頻率(mount frequency, MF):從雌鼠放入到雄鼠第1次射精之間的騎跨次數；插入頻率(intromission frequency, IF):從雌鼠放入到雄鼠第1次射精之間的插入次數(射精時的插入不計)；EF：1 h內雄鼠的射精次數；PEI:雄鼠第1次射精到再次插入的時間間隔；插入比例(intromission ratio, IR): IR=IF/(IF+MF)。

2 結 果

2.1 大鼠性行為過程描述大鼠的性行為是一個連續規律的過程，經歷嗅探、騎跨、插入、插入后舔陰、射精、射精后間隔等過程。嗅探(圖2A)：當雌鼠加入時，雄鼠會嗅探雌鼠的陰部。騎跨(圖2B)：雄鼠前肢放在雌鼠的背部，雌鼠或有向下弓腰的動作，整個過程持續大約1 s。插入(圖2C)：雄鼠前肢放在雌鼠背部，同時雌鼠向下弓腰，臀部翹起露出陰部，雄鼠胯部用力向前抖動，插入過程持續約1 s。雄鼠插入后迅速后撤并舔舐自己的陰莖(圖2D)。射精(圖2E)：經過多次的插入、后撤、舔陰過程后，雄鼠進行一次劇烈的深插，身體劇烈抽動后，前肢緩慢從雌鼠后背上抬起并張開，雌鼠前撤，雄鼠在短暫停頓后舔舐自己的陰部。射精過程大約持續3～5 s。隨后進入約5～10 min的射精后間隔(圖2F)。射精后間隔指雄鼠在射精后動作減少或趴下休息，在此期間不論雌鼠有何引誘行為，雄鼠均無較大反應。交配過程中，雌鼠會有一些引誘行為，如短促的跳躍、扭動或咬扯等。圖2為大鼠交配過程的典型動作圖。

A：嗅探；B：騎跨；C：插入；D：插入后舔陰；E：射精；F：射精后間隔。圖2 大鼠性行為過程典型動作圖

2.2 不同表型大鼠性行為特征84只雄性大鼠中，有30只大鼠在交配實驗中因無法完成完整的性行為過程(ML、IL或插入間隔過長且未射精)或不穩定(即交配實驗中3周的EF相差大于2)而被排除。

2.2.1EF建模方式 54只雄性大鼠，繪制EF的頻率分布直方圖，可以看出EF近似呈正態分布：EF～N(μ,σ2)(3.76,1.402)。P-P圖顯示EF分布的正態性較強(圖3)。

圖3 EF頻率分布直方圖(A)及正態P-P圖(B)

根據EF分布及10%[6]原則，將大鼠分為快速射精組(EF<3)、正常射精組(3≤EF≤5)及遲緩射精組(EF>5)，各組分別為5、41、8只，3組大鼠的EL明顯遞增(P<0.01)、EF明顯遞減(P<0.01)，其他參數差異無統計學意義(P>0.05)，其中ML與IL兩指標進一步多重比較結果顯示各組之間差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 EF建模方式中快速射精組、正常射精組及遲緩射精組雄鼠的性行為學特征

2.2.2EL建模方式 剩余54只雄性大鼠，繪制EL的頻率分布直方圖，可以看出EL近似呈正態分布：EL～N(μ,σ2)(1016.89,483.9662)。P-P圖顯示EL分布的正態性較強(圖4)。

圖4 EL頻率分布直方圖(A)及正態P-P圖(B)

根據正態分布的概率分布規律可知，EL在(μ-σ,μ+σ)區間概率較大，為68.27%。故我們將EL<μ-σ定義為快速射精組，μ-σ≤EL≤μ+σ定義為正常射精組。EL>μ+σ定義為遲緩射精組將54只大鼠根據EL分組，分別為9、36、9只，三組大鼠的EL明顯遞增(P<0.01)、EF明顯遞減(P<0.01)、IF和PEI有不同程度的差異，而MF、ML、IL以及IR差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 EL建模方式中快速射精組、正常射精組及遲緩射精組雄鼠的性行為學特征

2.2.3行為學參數間的相關性 EL和EF之間相關系數為-0.704(P<0.001)，提示EL與EF間相關性強。

3 討 論

WALDINGER教授等[7]提出的“射精分布理論”認為普通男性人群中IELT是連續的，PE男性的IELT是人群IELT生物變異中較小的部分，且后續的人群調查[8]及動物實驗[6]均證明了這一理論。目前原發性PE建模的方式主要基于射精分布理論，通過雄性大鼠交配實驗，根據EF將大鼠劃分為不同性行為表型的組別，從而篩選出快速射精的大鼠[10-11]，這類大鼠的性行為表現與PE患者很相似。根據EF建立原發性PE大鼠模型的數據表明，在快速射精、正常射精以及遲緩射精3組大鼠中EF表現為顯著減小、EL顯著增大，這與早泄患者的IELT比正常人短這一主要特征一致。ML是代表性欲的參數[12]，在3組大鼠中差異無統計學意義，這與臨床中原發性PE與性欲不相關這一特點相吻合[13]。在EL、EF、MF、ML、IL及IR這6個參數方面，EL建模方式與EF建模方式得出的結果相同，但在IF和PEI方面，EL建模方式顯示3組大鼠間有不同程度的差異，而EF建模方式卻未顯示出其差異。 快速射精大鼠的IF比遲緩射精大鼠小，代表快速射精大鼠更少的插入即可射精，這與原發性早泄患者少量插入即射精類似。PEI為射精后到再插入的時間間隔，與大鼠的恢復能力有關，可以看出快速射精大鼠比遲緩射精大鼠狀態恢復得更快。

以上分析可知，根據EL的建模方式比根據EF的建模方式能更好地體現出不同類型大鼠的性行為學差異。另外，以EF為參數建立原發性早泄模型無法排除PEI的影響，且EF還受到第2次及后續交配過程中其他參數的影響，這些都會增加誤差，但以EL為參數的建模方式不會受到上述影響。再者，相較于EF，EL與原發性PE患者的IELT同為從插入到射精的時間計量，關聯性較強。最后，EL和EF之間相關性較強(r=-0.704，P<0.001)，這也進一步證明了用EL建模的可行性。以上分析表明，以EL為參數建立原發性PE大鼠模型比以EF為參數的建模方式受到的影響因素更少，與IELT的關聯性更高，能更好地表現出不同類型大鼠間性行為學的差異。

在實驗過程中,我們發現根據EF建立原發性PE大鼠模型的方法存在需要改進之處：①在30 min內，大鼠的射精次數最多只能達到3次(這和其他研究有一定差異[14]。大鼠批次的差異或飼養環境的不同可能會導致這種差異)。為了擴大大鼠間行為學的差異，我們將交配時間增加到1 h。在此期間，大鼠的射精次數最多能達到7次。增加交配時長，可以擴大大鼠間EF的差距，有利于我們找到更穩定的快速射精大鼠。②在交配實驗前1周，對雌雄大鼠進行合籠，這樣可以加快雄鼠對交配行為的學習，加速雄鼠性行為的穩定。③在行為學錄像過程中，采用有夜視功能的影像系統，營造出完全黑暗的環境，能更大程度地減小環境對大鼠的影響。④部分大鼠在交配過程中，未能完成射精，有些大鼠甚至沒有插入。這部分大鼠很可能還未習得交配行為。另一方面，這一部分大鼠的EL實際值無法得出。故為了減少誤差，我們在建模過程中，對于未能完成射精的大鼠予以排除。⑤以EF為參數建模的10%原則[6]，將EF分布兩端10%的大鼠劃分為快速射精和遲緩射精組。由于這一比例較小，在實驗過程中為了篩選出一定數量的早泄大鼠，需要消耗更多的資源。所以我們根據EL呈正態分布的特征及正態分布概率區間，提出以μ-σ和μ+σ為分界，即將EL分布兩端約15.87%的大鼠劃分為快速射精和遲緩射精組。統計結果顯示，這樣的劃分方式可以篩選出符合原發性PE患者特征的快速射精大鼠，且擴大了納入范圍，減少了實驗消耗。

綜上所述，根據EL建立原發性PE大鼠模型的方法可行，且在某些方面優于以EF為參數的建模方式。希望這一建模方式能為以后原發性PE的機制研究提供幫助。