廉飛玥 李陽 姜凌峰 沈皓月 趙江月 嚴肖嘯 于佳明 秦宇
中國醫科大學附屬第四醫院眼科 遼寧省晶狀體學重點實驗室,沈陽110005
后發性白內障(posterior capsular opacification,PCO)是白內障術后嚴重影響視覺質量的并發癥之一,目前主要治療方式為YAG激光和二次手術。隨著患者對術后視覺質量要求的不斷提高,激光或手術治療帶來的人工晶狀體(intraocular lens,IOL)損傷或移位等并發癥逐漸得到重視。已有研究表明,360°連續直角邊緣IOL能有效抑制晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells,LECs)向后囊膜遷移,而不同360°連續直角邊緣IOL的PCO發生率存在差異。目前,關于不同360°連續直角邊緣IOL在PCO預防中作用的體外實驗研究仍然較少,其中一部分原因可能在于囊袋模型構建的限制。早期囊袋模型是由動物眼球囊袋及人晶狀體囊袋構建,除囊袋來源受限外,模型的穩定性也較差。近年來,使用細胞培養小室構建PCO體外囊袋模型的新方法出現,但該類模型尚無法準確模擬術后晶狀體囊內IOL與前、后囊膜的位置關系,缺乏對囊袋不同部位LECs狀態的反映,這些問題也是PCO預防研究的關鍵。本研究擬設計體外分區囊袋模型,為現有體外囊袋模型存在的問題提出可能的解決方案。同時,本研究擬使用體外分區囊袋模型比較目前常用的3種類型360°連續直角邊緣IOL對LECs遷移的抑制作用,為IOL改良以預防PCO提供新的參考和依據。
1.1.1
細胞來源 人LECs細胞系SRA01/04購于ATCC細胞庫,經過細胞STR驗證。1.1.2
IOL類型 使用3種一片式、光學部光滑無雕刻、后表面360°連續直角邊緣設計的IOL:平臺板式袢HydroSmart IOL、C型袢HydroSmart IOL和C型補償袢Hydrophobic IOL,其中平臺板式袢HydroSmart和C型袢HydroSmart光學設計為雙等凸0°袢夾角,C型補償袢Hydrophobic為后凸型。1.1.3
主要試劑及儀器 Transwell小室(REF3422,美國Corning公司);細胞爬片(WHB24CS、WHB48CS,上海臥宏生物科技有限公司);人源Ⅳ型膠原(C7521)、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)(GF113)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)(CAS-67685)(美國Sigma公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(FBSSA500-S,澳大利亞AusGeneX公司);DMEM高糖培養液(SH30021)、青-鏈霉素雙抗(SV-30010)(美國HyClone公司);蘇木素染液(MB9798-2)、伊紅染液(MAO164)(大連美侖生物技術有限公司)。熒光照相顯微鏡、解剖顯微鏡(日本Olympus公司);凝膠成像及分析系統(美國Alpha Iromotech公司);低溫超速離心機(美國Thermo公司);多功能酶標儀(德國Berthold公司)。1.2.1
體外分區囊袋模型構建及細胞培養 將Ⅳ型膠原均勻涂布于小室遷移膜上底面中央5 mm直徑范圍。于37 ℃濕潤環境中靜置8~24 h,直至形成穩定的膠原膜;同樣的方法制備8 mm和14 mm膠原膜細胞爬片,構建體外分區囊袋模型。體外分區囊袋模型可分為前囊膜區(小室下表面區)和后囊膜區(爬片區),后囊膜區又可分為后囊膜邊緣區(14 mm爬片區)和后囊膜袢光學部移行區(8 mm爬片區)(圖1)。將SRA01/04細胞培養于含體積分數10% FBS、100 U/ml(U為商品單位)青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養液中,于37 ℃、體積分數5% CO培養箱中常規培養,待細胞達75%融合時以質量分數0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代。調整細胞密度約5×10/ml,均勻接種于Transwell小室上底面和細胞爬片的周圍區域,培養6~8 h待細胞貼壁后,向小室中加入10 ng/ml的TGF-β,植入C型袢HydroSmart IOL作為模型組;并設置未植入IOL的Transwell小室作為對照組,細胞按同樣密度均勻接種于小室上底面及下室對應爬片的周圍區域。各組細胞分別于37 ℃、5% CO細胞培養箱中培養48 h,進行后續實驗。圖1 體外分區囊袋模型示意圖(標尺=6 mm) ◇:小室上底面晶狀體上皮細胞培養區;☆:遷移至小室下表面的晶狀體上皮細胞;?:細胞爬片周圍區域;↑:8 mm及14 mm細胞爬片Figure 1 The diagrammatic sketch of in vitro capsular bag model (bar=6 mm) ◇:Lens epithelial cells on the upper surface of the chamber;☆:Lens epithelial cells that migrated to the lower surface of the chamber;?:Area around cell slides;↑:8 mm and 14 mm cell slides
1.2.2
倒置顯微鏡下觀察體外分區囊袋模型早期PCO病理表現 體外培養細胞48 h,將體外分區囊袋模型Transwell小室、8 mm及14 mm細胞爬片拆分后各自放入含有DMEM培養液的24孔板中,倒置顯微鏡下觀察各區細胞分布,并觀察早期Sommering環和小型Elschning珍珠樣小體等PCO特征性病理表現。1.2.3
蘇木精-伊紅染色觀察體外分區囊袋模型細胞形態變化 體外培養細胞48 h,吸除Transwell小室培養孔細胞培養液及各爬片培養孔內細胞培養液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)浸洗2次;取上室下表面及下室細胞爬片上的細胞,質量分數4%多聚甲醛固定20 min,PBS輕柔浸洗;蘇木素染液浸染15~20 min,無菌水浸洗1次,伊紅浸染3~5 min,無菌水浸洗去除雜色;光學顯微鏡下觀察細胞纖維化狀態并拍照。1.2.4
實驗分組處理 根據IOL類型將實驗分為平臺板式袢HydroSmart組、C型袢HydroSmart組和C型補償袢Hydrophobic組,將相應類型IOL分別植入體外分區囊袋模型中,同時設置不植入IOL的體外分區囊袋模型作為空白對照組。參照1.2.1方法進行細胞接種和培養。1.2.5
Transwell法檢測IOL前囊膜區細胞遷移 各組細胞培養48 h,移除模型上室及下室細胞培養液,PBS浸洗30 s,于模型上室加入250 μl含5% FBS的新鮮培養液,下室加入500 μl含15% FBS的新鮮培養液,并置于37 ℃、5% CO細胞培養箱中繼續培養10 h;吸除小室培養液,用棉簽拭去上室上底面細胞,4%多聚甲醛固定后行蘇木精-伊紅染色。隨機選取前囊膜區3個等距視野作為計數區域(圖2A),倒置顯微鏡下拍照,采用ImageJ軟件計數遷移細胞;每組設置5個平行對照,計數單位面積為500 μm×400 μm,每張照片重復計數3次,取各組細胞計數的平均值作為最終細胞計數結果。前囊膜細胞遷移抑制率=(空白對照組前囊膜區單位面積細胞數-IOL組前囊膜區計數區域單位面積細胞數)/空白對照組前囊膜區單位面積細胞數×100%。1.2.6
細胞排斥區分析法檢測IOL后囊膜袢光學部移行區細胞遷移 各組細胞培養48 h,移除后囊膜區原細胞培養液、Transwell小室上室及IOL,PBS浸洗培養孔后加入不含血清的新鮮培養液,置于37 ℃、5% CO細胞培養箱中繼續培養24 h;取各組模型體系后囊膜區8 mm細胞爬片于新的24孔板細胞培養孔中,PBS浸洗、4%多聚甲醛固定,行蘇木精-伊紅染色。選取后囊膜袢光學部移行區2個對稱區域作為計數區域(圖2B),倒置顯微鏡下拍照,采用ImageJ軟件進行遷移細胞計數;每組設置5個平行對照,計數區域單位面積為1 500 μm×1 200 μm,每張照片重復計數3次,取平均值作為最終細胞計數結果。后囊膜細胞遷移抑制率=(空白對照組后囊膜袢光學部移行區單位面積細胞數-IOL組后囊膜袢光學部移行區單位面積細胞數)/空白對照組后囊膜袢光學部移行區單位面積細胞數×100%。圖2 體外分區囊袋模型計數區域示意圖(標尺=6 mm) 紅色標記框內為計數區域 A:前囊膜區計數區域 計數單位面積為500 μm×400 μm B:后囊膜袢光學部移行區計數區域 計數單位面積為1 500 μm×1 200 μmFigure 2 Cell counting areas in the in vitro capsular bag model (bar=6 mm) Areas within red boxes were cell counting areas A:Anterior capsule Cell counting area of 500 μm×400 μm B:Optical area of posterior capsule Cell counting area of 1 500 μm×1 200 μm
圖3 模型組與對照組體外分區囊袋模型對比觀察 A:對照組(標尺=500 μm) B:模型組(標尺=500 μm) 可見早期Soemmering環形態(箭頭) C:對照組細胞形態高倍鏡圖(標尺=100 μm) D:模型組細胞形態高倍鏡圖(標尺=100 μm) 可見小型Elschnig珍珠樣小體(箭頭)Figure 3 Morphological observation of model group and control group A:Control group (bar=500 μm) B:Model group (bar=500μm) Soemmering ring (arrow) in the early phase was observed C:High magnification image of control group (bar=100 μm) D:High magnification image of model group (bar=100 μm) Small Elschnig pearls (arrow) were found
t
檢驗。P
<0.05為差異有統計學意義。培養48 h后,倒置顯微鏡下觀察可見模型組后囊膜區細胞主要分布于后囊膜邊緣,遷移至IOL下方的細胞數目較少;后囊膜邊緣區可見類似早期Soemmering環的形態,并可見由后囊膜邊緣區向后囊膜中央遷入的不具有典型LECs結構、相對于人LECs體積較大的小型Elschnig珍珠樣小體形態。對照組下室對應區域未見類似形態改變(圖3)。
蘇木精-伊紅染色結果顯示,模型組小室下表面前囊膜區可見細胞的細胞質紅染,呈梭形、紡錘形,而對照組細胞呈三角形、長方形、橢圓形等;模型組后囊膜區可見遷移的細胞,細胞呈纖維狀,胞質較少,對照組下室對應區域可見細胞的細胞質較豐富且形態多樣(圖4)。
F
=1 287.00,P
<0.001),其中平臺板式袢HydroSmart組、C型袢Hydrosmart組、C型補償袢Hydrophobic組遷移至前囊膜區的細胞數目明顯少于空白對照組,C型補償袢Hydrophobic組遷移細胞數目明顯多于平臺板式袢HydroSmart組和C型袢Hydrosmart組,差異均有統計學意義(均P
<0.05)(圖5,表1)。各IOL組前囊膜區細胞遷移抑制率總體比較差異有統計學意義(F
=11.12,P
<0.001),其中C型補償袢Hydrophobic組遷移抑制率明顯低于平臺板式袢HydroSmart組和C型袢Hydrosmart組,差異均有統計學意義(均P
<0.01)(表2)。F
=4 018.00,P
<0.001),其中平臺板式袢HydroSmart組、補償袢Hydrophobic組和C型袢Hydrosmart組遷移細胞計數依次增加,各組間比較差異均有統計學意義(均P
<0.001)(圖5,表3)。各IOL組移行區細胞遷移抑制率總體比較差異有統計學意義(F
=87.04,P
<0.001),其中平臺板式袢HydroSmart組、補償袢Hydrophobic組和C型袢Hydrosmart組細胞遷移抑制率依次降低,組間差異均有統計學意義(均P
<0.001)(表4)。圖4 體外分區囊袋模型各分區細胞蘇木精-伊紅染色觀察 A:模型組前囊膜區細胞(標尺=50 μm) 細胞質紅染,呈梭形、紡錘形 B:對照組前囊膜區細胞(標尺=50 μm) 細胞呈三角形、長方形、橢圓形 C:模型組后囊膜區細胞(標尺=100 μm) 細胞呈纖維狀,細胞質較少 D:對照組后囊膜區細胞(標尺=100 μm) 細胞質較豐富、形態多樣Figure 4 Morphological observation of cells by hematoxylin and eosin staining in the in vitro capsular bag model A:Cells in the anterior capsule of model group (bar=50 μm) Cytoplasm showed red staining,fusiform and spindle-shaped B:Cells in the anterior capsule of control group (bar=50 μm) Cells were triangular,rectangular,and oval C:Cells in the posterior capsule of model group (bar=100 μm) Cells were fibrous with little cytoplasm D:Cells in the posterior capsule of control group (bar=100 μm) Cells were with abundant cytoplasm and had diverse shapes
圖5 各組體外分區囊袋模型前、后囊膜計數區域細胞蘇木精-伊紅染色(前囊膜區:標尺=100 μm;后囊膜袢光學部移行區:標尺=500 μm)Figure 5 Hematoxylin and eosin staining of cells in cell counting areas of the anterior capsule and posterior capsule (Anterior capsule:bar=100 μm;Optical area of the posterior capsule:bar=500 μm)
表1 各組體外分區囊袋模型前囊膜區遷移細胞數比較(x±s)Table 1 Comparison of the number of migrating cells in the anterior capsule among different groups (x±s)組別樣本量遷移細胞數目空白對照組15236.70±40.02C型補償袢Hydrophobic組1534.47±10.80aC型袢HydroSmart組1524.67±9.80ab平臺板式袢HydroSmart組1518.80±5.53abF值1 287.00P值<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.001;與C型補償袢Hydrophobic組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with blank control group,aP<0.001;compared with C-compensation-loop Hydrophobic group,bP<0.05 (One-way ANO-VA,LSD-t test)
表2 各IOL組體外分區囊袋模型前囊膜區細胞遷移抑制率比較(x±s,% )Table 2 Comparison of cell migration inhibition rate in the anterior capsule among different groups (x±s,% )組別樣本量細胞遷移抑制率C型補償袢Hydrophobic組1586.27±4.54C型袢HydroSmart組1589.76±3.10a平臺板式袢HydroSmart組1592.02±1.94aF值11.12P值<0.001 注:與C型補償袢Hydrophobic組比較,aP<0.01(單因素方差分析,LSD-t檢驗) IOL:人工晶狀體 Note:Compared with C-compensation-loop Hydrophobic group,aP<0.01(One-way ANOVA,LSD-t test) IOL:intraocular lens
表3 各組體外分區囊袋模型后囊膜袢光學部移行區遷移細胞數比較(x±s)Table 3 Comparison of the number of migrating cells in the optical area of the posterior capsule among different groups (x±s)組別樣本量遷移細胞數目空白對照組10568.60±82.53C型補償袢Hydrophobic組10121.30±12.01aC型袢HydroSmart組10162.20±16.38ab平臺板式袢HydroSmart組1056.43±9.00abcF值4 018.00P值<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.001;與C型補償袢Hydrophobic組比較,bP<0.001;與C型袢HydroSmart組比較,cP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗) Note:Compared with blank control group,aP<0.001;compared with C-compensation-loop Hydrophobic group,bP<0.001;compared with C-loop HydroSmart group, cP<0.001(One-way ANOVA,LSD-t test)
表4 各IOL組體外分區囊袋模型后囊膜袢光學部移行區細胞遷移抑制率比較(x±s,%)Table 4 Comparison of cell migration inhibition rate in the optical area of the posterior capsule among different groups (x±s,%)組別樣本量細胞遷移抑制率C型補償袢Hydrophobic組1078.43±3.48C型袢HydroSmart組1070.14±5.35a平臺板式袢HydroSmart組1091.60±3.65abF值87.04P值<0.001 注:與C型補償袢Hydrophobic組比較,aP<0.001;與C型袢Hydr-oSmart組比較,bP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗) IOL:人工晶狀體 Note:Compared with C-compensation-loop Hydrophobic group,aP<0.001;compared with C-loop HydroSmart group, bP<0.001(One-way ANOVA,LSD-t test) IOL:intraocular lens
PCO是白內障手術IOL植入后重要的并發癥之一,其特征性改變為形成Elschnig珍珠樣小體和Soemmering環。LECs繞過前囊膜邊緣或由晶狀體囊赤道部向后囊膜光學部中心區域遷移是PCO的早期改變,發生這一變化的主要原因是術后血-房水屏障破壞,大量細胞因子和炎性因子涌入前房和晶狀體囊內,導致LECs異常遷移。目前常見的生物囊袋模型和細胞孔室模型穩定性較差,且無法反映前后囊膜與IOL間的位置關系,關于PCO體外囊袋模型的構建與評估目前尚未形成統一的標準。體外分區囊袋模型利用Ⅳ型膠原形成的膠原膜構建一個48 h內相對穩定的囊內微環境,從而更好地模擬人LECs、晶狀體囊膜及IOL間的相互作用,實現了對晶狀體囊不同部位的分區模擬,有助于更精準、高效地探討不同設計特點的新型IOL對PCO的預防和治療作用,為IOL預防PCO的相關研究提供了一種新方法。盡管如此,體外分區囊袋模型依然有很大的局限性,例如該模型尚無法模擬術后液體環境中細胞因子等的動態變化,下一步可以在模型中增加一個梯度緩釋系統。另外,體外分區囊袋模型目前只能用于評估PCO早期細胞的遷移,尚無法體現更長期的病理改變,如囊膜皺縮等,未來可以通過選擇更多新型材料,如玻璃膠原膜等來代替現有模型中的膠原膜,既保持了體外分區囊袋模型的穩定性,也更好地模擬了晶狀體囊,從而實現長期的研究觀察。
目前關于IOL改良預防PCO的研究主要可以分為材質、形狀設計及藥物浸潤,本研究主要討論IOL的材質與形狀設計,根據材質分為HydroSmart型和Hydrophobic型,根據IOL袢的設計特點分為平臺板式袢和C型袢,根據袢光學部移行區設計特點分為雙等凸球面和補償袢。有臨床研究結果顯示,Hydrophobic型IOL能有效預防PCO的發生。近年來,一些新型材質IOL也被證明能有效預防PCO的發生。而對近幾年出現的HydroSmart型IOL預防PCO作用的研究仍較少。本研究結果表明,平臺板式袢HydroSmart型IOL在LECs遷移抑制中的作用優于C型袢HydroSmart型IOL及C型補償袢Hydrophobic型IOL。本研究在體外分區囊袋模型中觀察到HydroSmart型IOL在細胞培養過程中有一定程度的體積增大,這可能鈍化了IOL后表面的直角邊緣,但使其與囊膜的貼合度更好,這可能是導致細胞遷移抑制率較其他材質IOL高的原因。同時,本研究發現平臺板式袢IOL和C型補償袢IOL相對于C型袢IOL對人LECs向后囊膜中央區遷移有更強的抑制作用。近年研究表明圓盤中空袢IOL、后表面雕刻IOL及可調節折疊IOL能有效預防PCO;但也有研究結果顯示不同IOL袢的數目和形狀對PCO的預防作用差異無統計學意義。結合本研究結果,我們有理由認為增加IOL袢邊緣與晶狀體囊袋的接觸面積、減少IOL袢光學部移行區與袢邊緣區的連接以及增加IOL與囊袋接觸的摩擦力可能會增強IOL對PCO的抑制作用,這也為將來更多新型IOL的設計提供了方向。
綜上,本研究成功建立一種體外分區囊袋模型,并且通過體外實驗結果證實,與C型袢HydroSmart IOL、C型補償袢Hydrophobic IOL相比,平臺板式袢HydroSmart IOL更有利于抑制LECs向前后囊膜的遷移。本研究結果仍需進一步結合臨床研究進行驗證和完善。
利益沖突
本研究曾受到蔡司、高視遠望和眼力健公司的資助,所有作者均聲明不存在其他利益沖突作者貢獻聲明
廉飛玥:實施研究、論文撰寫;李陽:實施研究;姜凌峰、沈皓月、嚴肖嘯:數據整理、統計分析;趙江月、于佳明:論文修改;秦宇:醞釀和設計實驗、研究指導、論文修改及定稿