基于UHPLC-HRMS探討水楊梅根水提物對大鼠血漿代謝物的影響

陳欣欣，黃彩瑩，仇雯霞，謝雪焜，李定樺，陳 闖*

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021)

茜草科植物水楊梅(AdinarubellaHance)是我國一種傳統民間用藥，又稱水楊柳、水泡木、小葉水團花、串魚木等，主要分布于江蘇、浙江、福建、廣東和廣西等地。水楊梅的根和地上部位均可作為藥用部位，其味苦、辛，性涼，具有清熱解表、活血解毒的功效，主要用于濕熱泄瀉、瘡癤腫毒等[1]?，F代藥理研究表明，水楊梅根提取物能抑制人肝癌Bel7402細胞[2]、人直腸癌LS174T細胞[3]、小鼠L651白血病細胞和子宮頸癌細胞[4]的增殖。此外，研究發現在實驗質量濃度范圍內，水楊梅的各萃取部位(石油醚、醋酸乙酯和正丁醇)，以及水楊梅石油醚萃取部位分離得到的甾體化合物，對金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌和枯草芽胞桿菌有一定的抑菌活性，且對革蘭陽性菌的抑制作用強于革蘭陰性菌[5]。而目前研究多關注水楊梅根的化學成分[6-8]和體外生物活性，對體內代謝組學研究較少。液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS)以LC對化合物進行分離、MS進行定性分析，是一種簡單、靈敏、快速的分析方法，已被廣泛應用于血清藥物化學分析和體內代謝研究等領域[9-13]。本研究基于UHPLC-Q-Exactive 軌道阱高分辨質譜技術，從血漿代謝組學角度探討水楊梅根水提物對大鼠體內血漿代謝物的影響，為水楊梅根的藥效物質研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 水楊梅根藥材購于廣西仙茱中藥科技有限公司，經廣西仙茱中藥科技有限公司黎秀按《廣東省中藥材標準(第一冊)》(2004年版)[14]鑒定為茜草科植物細葉水團花AdinarubellaHance 的干燥根，產地為廣東。質譜級甲醇(Methanol)、乙腈(Acetonitrile)、甲酸(Formic acid)均為CNW Technologies 公司產品。L-2-氯苯丙氨酸(2-Chloro-L-phenylalanine)純度≥98%，購自上海恒柏生物科技有限公司。分析用水為Merck Millipore 純水，其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 1290 UHPL型超高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Q Exactive Focus 型高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm 2.1×100 mm型色譜柱(美國Waters公司)；Heraeus Fresco17 型離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BSA124S-CW型天平(德國Sartorius)；JXFSTPRP-24 型研磨儀(上海凈信科技有限公司)；YM-080S 型超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)；熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.1.3 動物 Sprague Dawley (SD)大鼠18只，體質量(150±10) g，購于廣西醫科大學(廣西實驗動物中心)，生產許可證號：SCXK桂2014-0002，使用許可證號：SCXK桂2014-0003。大鼠飼養于廣西醫科大學動物房(普通級)：12 h晝夜循環，具有空調設備，室溫恒定在26 ℃，濕度55%～65%，自由飲食飲水，實驗前適應性飼養7 d。

1.2 方法

1.2.1 水楊梅根干膏制備 取5 000 g水楊梅根藥材(飲片)，分兩次煎煮。第1次加10倍量的水，先浸泡0.5 h，加熱煎煮1.5 h，第2次加水8倍量，煎煮1 h，煎液過濾，合并兩次提取液，濾液濃縮成稠膏后置于鼓風干燥箱(75 ℃)72 h，即得到干浸膏約409.5 g，出膏率為8.19%，置于玻璃干燥皿中備用。

1.2.2 給藥與樣品采集 SD大鼠隨機分為空白組、水楊梅根水提物給藥組，每組9只，兩組大鼠給藥前禁食12 h(可自由飲水)?！吨腥A本草》[15]記載水楊梅根的人體最大用量為每天30 g，根據大鼠與人的體表面積換算率(6.3)及水楊梅根出膏率(8.19%)，計算大鼠日劑量為15.48 g/kg(干膏量)。將“1.2.1”所制的干膏溶解于純水中，配成1.548 g/mL水楊梅根水提物溶液灌胃給予大鼠，1次/d，連續給藥3 d，空白組灌服純水。末次給藥2 h后異氟醚麻醉，腹主動脈取血置于5 mL含肝素鈉采血管中，3 000 rpm室溫離心10 min，取上清，0.5 mL/管分裝至1.5 mL離心管中，-80 ℃凍存，備用。

1.2.3 生物樣本處理 取400 μL血清樣本，加入40 μL鹽酸(2 mol/L)；4 ℃ 渦旋1 min后靜置15 min；重復渦旋靜置4次后，加入1.6 mL乙腈沉淀蛋白；渦旋5 min，12 000 rpm[離心力13 800(×g)，半徑8.6 cm]離心5 min，取上清1 800 μL氮吹干燥；加入150 μL 80%甲醇(內標L-2-氯苯丙氨酸濃度為10 μg/mL)復溶，渦旋5 min，12 000 rpm[離心力13 800(×g)，半徑8.6 cm]離心5 min；取上清至進樣瓶中上機檢測。

1.2.4 上機檢測條件 色譜條件：色譜柱UPLC BEH C18(1.7 μm；2.1 mm×100 mm)；柱溫為55 ℃；流動相：A為水(含0.1%甲酸)；B為乙腈(含0.1%甲酸)；梯度洗脫條件：0～11 min，85～25%A；11～12 min，25～2%A；12～14 min，2～2%A；14～14.1 min，2～85%A；14.1～15 min，85～85%A；15～16 min，85～85%A；流速 500 μL/min；進樣量5 μL。

質譜條件：利用軟件(Xcalibur，Thermo Fisher Scientific)控制Q Exactive Focus 質譜儀，基于FullScan-ddMS2功能進行一級、二級質譜數據采集。詳細參數如下：鞘氣流速：45 arb，輔助氣流速：15 arb，毛細管溫度：400 ℃，分辨率(full scan)：70 000，分辨率(MS/MS scans)：17 500，碰撞能量：NCE 模式下的15/30/45，噴霧電壓：4.0 kV(正離子模式)或-3.6 kV(負離子模式)。

1.2.5 統計學處理 將獲得的正負離子模式下的原始數據導入XCMS軟件進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。數據預處理方式如下[16]：基于相對標準偏差(RSD，即變異系數Coefficient of variation，CV)對偏離值進行過濾，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數據，然后對原始數據中的缺失值進行模擬(Missing value recoding)，數值模擬方法為最小值二分之一進行填補。利用上海百趣生物醫學科技有限公司提供的二級質譜數據庫及相應裂解規律匹配法對含有MSMS數據的峰進行物質鑒定。使用SIMCA軟件(V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，Umea，Sweden)，對數據進行對數(LOG)轉換及CTR(Center scaling)格式化處理，然后進行無監督的PCA分析。將數據進行UV (Unit variance scaling)格式化處理，對第一主成分進行OPLS-DA建模分析，模型的質量用7折交叉驗證(7-fold cross validation)進行檢驗；然后用交叉驗證后得到的R2Y(模型對分類變量Y的可解釋性)和Q2(模型的可預測性)對模型有效性進行評判；最后通過置換檢驗(Permutation test)，隨機多次改變分類變量Y的排列順序得到不同的隨機Q值，對模型有效性做進一步檢驗。采用以下條件進行差異代謝物篩選：學生t檢驗(Student’st-test)的P值(P-value)<0.05，同時OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(Variable importance in the projection，VIP)>1。使用omicshare.com/tools(https：//www.omicshare.com/tools/)在線數據分析平臺將正負離子模式下的差異代謝物可視化。利用MetaboAnalyst 5.0(https：//www.metaboanalyst.ca/)在線數據庫獲取差異代謝物的KEGG ID號并進行差異代謝通路分析。

2 結果

2.1 基于 UHPLC-Q-Exactive MS的大鼠血漿代謝組學質量控制

從18個樣本中各取等量血漿充分混合后得到質控(Quality control，QC)樣本。使用該QC樣品進行過程質控和數據質控。在正負離子模式下，QC樣品總離子流色譜圖(Total ion chromatorgraphy，TIC)色譜峰保留時間和信號強度均重疊較好(見圖1)。在正離子模式下，內標響應穩定性的RSD為8.36%，在負離子模式下，內標響應穩定性的RSD為3.45%(見表1)，均小于20%。上述結果說明樣品處理方法和檢測系統穩定性均滿足代謝組學研究要求，本次實驗數據質量可靠。

注：A.所有QC樣品正離子TIC；B.所有QC樣品負離子TIC。

表1 QC樣品中內標響應穩定性

2.2 數據處理

正離子模式的原始數據包含33 291個Peak，經數據預處理后，19 064個Peak被保留。同理，負離子模式的原始數據包含26 444個Peak，經數據預處理后13 338個Peak被保留。利用上海百趣生物醫學科技有限公司提供的二級質譜數據庫對所有代謝物進行物質信息搜索整理，正離子模式下鑒定出187個化合物，負離子模式下鑒定出116個化合物。正負離子模式下，空白組和給藥組數據矩陣經無監督的PCA分析結果顯示(見圖2)，兩組血漿樣本代謝輪廓可呈現出分離趨勢。后續的OPLS-DA分析顯示(見圖3)，兩組樣本區分非常顯著。且所建立的OPLS-DA模型在正離子模式下R2Y=0.986，Q2=0.628；在負離子模式下R2Y=0.992，Q2=0.677，均表明其穩健可靠。隨后進行的200輪置換檢驗顯示(見圖3)，原模型R2Y非常接近1，說明建立的模型符合樣本數據的真實情況；原模型Q2比較接近1，說明如果有新樣本加入模型，可得到比較近似的分布情況，總體看，原模型可較好解釋兩組樣本之間的差異。置換檢驗隨機模型的Q2值均<原模型的Q2值；Q2的回歸線與縱軸的截距<0；且隨著置換保留度逐漸降低，置換的Y變量比例增大，隨機模型的Q2逐漸下降，說明原模型具有良好的穩健性，不存在過擬合現象。

注：A.正離子模式 PCA 分析；B.負離子模式 PCA 分析。

2.3 生物標志物的篩選和代謝通路分析

通過篩選OPLS-DA模型中VIP>1且學生t檢驗P<0.05的變量，正離子模式下，篩選出29個差異代謝物(見圖4A)，其中10-acetyloxy-8，8-dimethyl-2-oxo-9，10-dihydropyrano[2，3-f]chromen-9-yl) (Z)-2-methylbut-2-enoate(白花前胡素A)等17個代謝物上調，Totarol(桃柁酚)等12個代謝物下調；負離子模式下篩選出17個差異代謝物，其中5-Ethoxy-10-gingerol(5-乙氧基-10-姜酚)等10個化合物上調，16-Hydroxyhexadecanoic acid等7個化合物下調(見圖4B)。將正負離子模式下的差異代謝物合并為一個數據矩陣，其中16個化合物被KEGG數據庫收錄(見表2 )。使用MetaboAnalyst 5.0在線數據庫對差異代謝物進行通路富集分析和拓撲分析，篩選潛在的靶標通路(Pathway impact≥0.10)[17]。結果見圖5，橫坐標Pathway impact的值越大，代謝通路越重要；縱坐標-log10(P)的值越大，代謝通路富集分析的顯著性越好。代謝通路分析顯示，水楊梅根可影響到脂肪酸生物合成、色氨酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成和花生四烯酸代謝4條通路。

注：A.正離子模式 OPLS-DA 分析；B.負離子模式 OPLS-DA 分析；C.正離子模式下 200 輪置換檢驗結果；D.負離子模式下200 輪置換檢驗結果。

注：A.正離子模式下的差異代謝物熱圖；B.負離子模式下的差異代謝物熱圖；不同位置的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量。

表2 差異代謝物中被KEGG收錄的化合物

注：1.Fatty acid biosynthesis(脂肪酸生物合成)；2.Tryptophan metabolism(色氨酸代謝)；3.Biosynthesis of unsaturated fatty acids(不飽和脂肪酸的生物合成)；4.Arachidonic acid metabolism(花生四烯酸代謝)。

3 討論

單味中藥是中醫藥防治疾病的基礎，對單味中藥的研究不僅關乎臨床療效，也為中藥的合理應用提供依據。本研究基于UHPLC-Q-Exactive MS技術，對水楊梅根進行了非靶向血漿代謝組學分析。在正負離子模式下，給藥組大鼠血漿對比空白對照組大鼠血漿共篩選鑒定出45種差異代謝物，花生四烯酸代謝通路影響值為0.333，其余3條通路的通路影響值為0。因此，筆者認為水楊梅根可通過影響花生四烯酸代謝而發揮作用。

水楊梅根治療瘡癤腫毒是其重要的臨床應用之一。本研究發現，水楊梅根可下調血漿中的花生四烯酸水平?；ㄉ南┧?AA)是二十碳不飽和脂肪酸，當細胞受刺激后，細胞膜的磷脂酶(PLA)被激活，進而裂解膜磷脂，游離出花生四烯酸，后者通過環加氧酶和脂質加氧酶作用生成前列腺素(PG)、血栓素 A2(TXA2)和白三烯(LT)等炎性介質，從而導致局部和全身的炎癥反應發生[18]。因此，筆者認為水楊梅根下調血漿中的花生四烯酸水平與其抗炎作用相關，這為今后通過干預大鼠瘡瘍模型，探討水楊梅根是否能回調模型動物的炎癥相關代謝物水平提供了參考依據。

臨床上，水楊梅根常配伍藤梨根及虎杖根辨證治療消化道惡性腫瘤，療效確切[6，19]。張蓓等[20]用水楊梅總黃酮對S180荷瘤小鼠進行灌胃，證實了水楊梅總黃酮可提高其免疫功能，抑制腫瘤生長，且安全性好。葉勇等[3]用不同濃度的水楊梅根提取物處理人直腸癌LS174T細胞發現，藥物抗癌作用表現為劑量依賴性，且乙酸乙酯提取部位是最主要的活性部位。此外，王成功等[2]發現水楊梅根乙酸乙酯提取物可體外抑制人肝癌Bel7402細胞增殖，其機制可能與p53基因表達上調、survivin表達下調而促進Bel7402細胞凋亡有關。研究證明，生理性血小板受體和血小板激動劑在癌癥轉移及血管生成中起重要作用。血小板提供促凝表面，促進惡性腫瘤相關凝血功能，且可被募集以覆蓋腫瘤細胞，從而保護它們免受免疫反應的影響，并促進癌癥的生長和傳播[21]，表明抗血小板聚集可能是腫瘤治療的新策略。方晴霞等[22]發現水楊梅根黃酮類成分(ARF)能抑制5＇-二磷酸腺苷(ADP)、血小板活化因子(PAF)及AA所誘導的血小板聚集，且隨ARF劑量的增加，對血小板的聚集抑制率顯著上調。TXA2可降低血小板內環磷酸腺苷(cAMP)濃度，對血小板的聚集有正反饋促進作用[23]。本研究發現水楊梅根能降低血漿中AA水平，提示其可能通過影響TXA2，從而抑制血小板聚集發揮抗癌作用。

本研究初步闡明了水楊梅根對大鼠血漿代謝物的影響，從代謝組學角度為草藥水楊梅根的藥效物質研究提供了一定依據。但筆者發現鑒定出的化合物部分未被KEGG注釋，因而基于KEGG數據庫代謝通路分析所得到的信息有限，這導致一些潛在且有價值的差異代謝物作用機制未被闡明，今后還需結合其他藥理學方法進行機制探索。