山茱萸多糖提取工藝優化及對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

任俊鵬，楊志萍，陳貴堂，綦國紅

中國藥科大學工學院/國家中藥材加工技術研發專業中心（南京 211198）

中藥中常用的山茱萸是山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）的干燥成熟果肉，又名藥棗、萸肉、山萸肉等，主要來自我國中部，如山西、河南、湖南等省份，具有補益肝腎、收澀固脫等作用[1]，中醫中常用于治療糖尿病、癌癥和休克等疾病，含有多糖、三萜、環烯醚萜、有機酸、黃酮和鞣質等成分。近幾年對山茱萸多糖的研究主要集中在提取分離和藥理活性方面。山茱萸多糖提取分離常用方法是熱水提取法，此方法時間長，能耗高，提取率低。超聲提取法，利用超聲波產生的空化、振動、粉碎、攪拌等效應破壞細胞壁，增加溶劑穿透力，提高提取率，縮短提取時間[2]。

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）成為嚴重威脅人類健康的慢性疾病之一[3]，患者多以注射胰島素和長期服用降血糖藥物來控制血糖。α-葡萄糖苷酶存在于人體小腸黏膜細胞中，參與人體糖代謝，使碳水化合物分解為易于被人體吸收的單糖，能夠導致糖尿病患者餐后血糖上升。α-葡萄糖苷酶抑制劑通過競爭性抑制α-葡萄糖苷酶活性，使碳水化合物緩慢分解為葡萄糖，從而控制糖尿病患者餐后血糖水平。α-葡萄糖苷酶抑制劑是糖尿病人的臨床用藥，多以化學合成或微生物發酵法獲得，雖有良好的藥效，但長期服用毒副作用明顯[4]。因此尋找天然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑將成為今后糖尿病治療的新思路。試驗在超聲輔助提取山茱萸多糖工藝優化的基礎上，進一步探究山茱萸多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，考察其降血糖活性的潛質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸，產地安徽亳州，于60 ℃烘干8 h，粉碎，過0.180 mm（80目）篩，于-4 ℃密封保存備用。

D-無水葡萄糖（上海凜恩科技發展有限公司）；苯酚（上海晶純生化科技股份有限公司）；98%硫酸（南京化學試劑股份有限公司）；α-葡萄糖苷酶（上海源葉生物科技有限公司）；阿卡波糖（上海源葉生物科技有限公司）；對硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（PNPG，北京伊諾凱科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；RE-5205型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；JY-92IIN型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Elx800多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸粗多糖提取工藝流程

一定質量的山茱萸粉與蒸餾水按一定比例的料液比置于250 mL錐形瓶中超聲，冷卻后離心（4000 r/min，10 min），取上清液，定容至250 mL，即為待測液。將待測液濃縮2.5倍，按1∶4（V濃縮待測液∶V無水乙醇）加乙醇沉淀多糖，離心（4000 r/min，10 min），取沉淀，于-50 ℃真空干燥，得到山茱萸粗多糖[5-6]。

1.3.2 標準曲線的繪制

按照文獻[5]方法以葡萄糖溶液的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0105X+0.052和相關系數R2=0.9991。

1.3.3 山茱萸粗多糖提取率的測定

按1.3.2法進行測定，將吸光度帶入回歸方程，得待測液中多糖質量濃度，計算多糖質量，按式（1）計算山茱萸多糖提取率。

式中：A為待測液吸光度；0.052為標準曲線截距；0.010 5為標準曲線斜率；10為待測液稀釋倍數；0.25為待測液體積，L；3為山茱萸原料質量，g。

1.3.4 山茱萸粗多糖提取單因素試驗

1.3.4.1 超聲提取溫度對提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲時間、超聲功率和料液比，測定溫度分別為40，50，60，70和80 ℃時山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.2 超聲提取功率對提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲時間、超聲溫度和料液比，測定功率分別為400，425，450，475和500 W時山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.4.3 超聲提取時間對提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，加90 mL蒸餾水，恒定超聲功率、超聲溫度和料液比，測定超聲時間分別為20，30，40，50和60 min時山茱萸粗多糖的提取率[5-6]。

1.3.4.4 超聲提取料液比對提取率的影響

取3.0 g山茱萸樣品，恒定超聲功率、超聲溫度和超聲時間，測定料液比分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）時山茱萸粗多糖的提取率。

1.3.5 山茱萸粗多糖提取正交試驗

在4個單因素試驗基礎上，從每個單因素的5個水平中選取3個水平。以粗多糖提取率（%）為考察指標，采用四因素三水平的正交試驗，按照L9(34)標準正交表進行正交試驗設計，優化山茱萸粗多糖的提取工藝條件。

1.3.6 山茱萸粗多糖提取的驗證試驗

分別稱取3份3.0 g山茱萸樣品，按照正交設計試驗得出的超聲提取的最佳工藝條件，進行提取并計算粗多糖提取率。

1.3.7 山茱萸粗多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

按文獻[7]方法，磷酸緩沖液（PBS）pH6.8，α-葡萄糖苷酶濃度0.2 U/mL，底物（PNPG）濃度10 mmol/mL，Na2CO3濃度1 mol/L。加入底物前于37 ℃反應20 min，加入底物后于37 ℃反應40 min，最后加入Na2CO3溶液終止反應，反應步驟如表1所示。

表1 PNPG法測α-葡萄糖苷酶活性步驟參數

反應結束后于410 nm波長酶標儀測定吸光度，山茱萸粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率按式（2）計算。

2 結果與分析

2.1 山茱萸粗多糖提取單因素試驗結果

2.1.1 超聲提取溫度的確定

如圖1所示，超聲溫度對提取率影響較大，溫度40～70 ℃范圍內多糖提取率隨溫度升高而增加，超聲溫度大于60 ℃時提取率增長變緩，70 ℃時達到最高，提取溫度大于70 ℃時提取率呈現下降趨勢。因此，最佳提取溫度為70 ℃。

圖1 超聲提取溫度對山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.2 超聲提取功率的確定

如圖2所示，超聲功率400～475 W范圍內，粗多糖提取率隨提取功率升高而增大，在475 W時提取率達到最高，然后提取率隨提取功率升高而略有下降。分析其原因：隨著超聲功率升高，超聲波帶來的空化作用越來越大，增加山茱萸細胞壁的破壞程度，使細胞內物質滲出加快，山茱萸多糖提取率增大。超聲功率大于475 W時，空化作用增強使雜質含量增加，多糖提取率變化不大，而且功率越大能耗越高。綜合考慮，提取功率選擇475 W。

圖2 超聲提取功率對山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.3 超聲提取時間的確定

如圖3所示，超聲時間10～50 min時，隨時間延長細胞破碎程度增大，多糖提取率隨之增大，并在50 min時達到最大值，提取時間超過50 min時，隨時間延長粗多糖提取率略有下降。綜合考慮，提取時間選擇50 min。

圖3 超聲提取時間對山茱萸粗多糖提取率的影響

2.1.4 料液比的確定

如圖4所示，料液比1∶10～1∶30 g/mL時山茱萸粗多糖提取率呈上升趨勢，料液比1∶30 g/mL時，提取率達最大。隨料液比中液體比例的增加，提取率呈現下降趨勢。料液比中液體比例較大時，溶質溶出較快，同時可能導致溶出雜質較多，所以提取率出現波動。同時料液比中液體比例增大會增加濃縮時間與能耗，綜合考慮，最佳料液比為1∶30 g/mL。

圖4 料液比對山茱萸粗多糖提取率的影響

2.2 正交試驗與結果

在單因素試驗的基礎上，以粗多糖提取率（%）為考察指標，選取超聲溫度（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）、料液比（D）4個因素，每個因素3個水平，按照L9(34)標準正交表進行正交試驗設計。正交試驗因素及水平如表2所示，試驗結果見表3。

表2 正交試驗因素及水平

根據表3中R值（極差）可知，試驗考察的影響山茱萸多糖提取率的各因素的次序為A＞B＞D＞C，其中A較為顯著，B、D和C為一般顯著性水平。通過對表3中K1、K2、K3分析可知，山茱萸粗多糖提取的最佳工藝條件是A1B1C3D2，即超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時間50 min、料液比1∶30 g/mL。

表3 正交試驗設計及結果

2.3 重現性試驗

根據正交試驗確定的最佳提取工藝條件，即超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時間50 min、料液比1∶30（g/mL），進行3次平行試驗，試驗結果分別為30.36%，30.45%和30.48%，平均值為30.43%，相對標準偏差（SRSD）為0.21%，試驗重現性良好，該提取條件對山茱萸粗多糖的提取效果較好。

2.4 山茱萸粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由圖4可知，山茱萸粗多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈量效關系，10 mg/mL時抑制率達70%，說明山茱萸多糖可以有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，具有降血糖的潛質。

圖5 山茱萸粗多糖、阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結論與討論

通過單因素試驗和正交試驗，對山茱萸粗多糖的超聲提取工藝進行優化，確定最佳提取條件：超聲溫度60 ℃、超聲功率450 W、超聲時間50 min、料液比1∶30（g/mL），并在此條件下進行驗證試驗，山茱萸粗多糖提取率達30.43%。該提取工藝時間短，提取率較高，耗能較少。研究表明，不同的提取方法不但影響多糖的提取效率，而且影響多糖的分子量、單糖組成、結構以及生物活性。在多糖提取中，不同提取方法對同種原料產生效果不同，而超聲輔助提取山茱萸粗多糖，對結構和活性的改變仍有待研究。糖尿病患者餐后血糖升高可以通過服用α-葡萄糖苷酶的抑制劑進行控制，阿卡波糖是α-葡萄糖苷酶的抑制劑，臨床上常用于治療2型糖尿病導致的餐后血糖升高。對α-葡萄糖苷酶活性的抑制試驗表明山茱萸粗多糖對α-葡萄糖苷酶活性具有較好的抑制作用，10 mg/mL時抑制率達70%，是同濃度下阿卡波糖的79%，為其在降血糖活性方面的應用提供理論依據。