異東莨菪內酯與東莨菪內酯吸收光譜和熒光光譜的比較研究

呂 芳, 李婷婷, 曹津津, 牛祿辰, 韓博聰, 魏雄飛, 李文紅,*

(1. 河北工業職業技術大學 高等職業教育研究所, 河北 石家莊 050091; 2. 河北工業職業技術大學 環境與化學工程系, 河北 石家莊 050091)

香豆素類化合物是一類以苯并吡喃酮為母核的有機天然化合物, 在自然界中廣泛存在, 是許多中藥的活性成分。 異東莨菪內酯(Isoscopoletin)和東莨菪內酯(Scopoletin)為苯環取代的香豆素類化合物(見圖1), 互為同分異構體。 異東莨菪內酯存在于杜鵑屬(Rhododendron.L)、菊科植物燈盞花(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand. Mazz)、刺異葉花椒(Z. dimorphophyllum var. spinifolium)等植物中, 東莨菪內酯存在于傘形科植物安興白芷(Angelica dahurica)、菊科植物黃花蒿(Artemisia annual inn.)和茵陳蒿(Artemisia capillaries)、旋花科植物丁公藤(Erycibe obtusifolia Benth.)、華山參、枸杞子等植物中, 二者具有抗腫瘤[1-3]、預防高血壓[4]、抗焦慮[5]、抗炎[6]、預防糖尿病[7]以及其他的藥理作用[8-10]。 一般采用HPLC-UV[11-12]、LC-MS[13]、薄層色譜[14-15]、電極法[16]對異東莨菪內酯和東莨菪內酯的含量進行測定。 東莨菪內酯的熒光光譜和解離常數有相關文獻報道[17-18], 異東莨菪內酯的紫外可見吸收光譜和熒光光譜未見相關報道。本文從分子結構出發，對比研究二者吸收光譜和熒光光譜的變化, 探尋分子結構與光譜變化的關系。 本文在研究過程中發現, 紫外吸收光譜中, 異東莨菪內酯和東莨菪內酯在堿性條件下的差異明顯; 熒光光譜中, 東莨菪內酯在酸性、堿性條件下均可產生強熒光, 而異東莨菪內酯在酸性、堿性條件下產生的熒光相對較弱, 二者的熒光峰、熒光量子產率和在甲醇環境下的熒光峰也具有明顯的差異性。 通過綜合比較二者在各種實驗條件下的吸收光譜和熒光光譜, 解釋了異東莨菪內酯(6-OH)和東莨菪內酯(7-OH)在各種實驗條件下可能的存在形態(分子型體、離子型體、水解產物)及其呈現不同光譜特征的分子結構原因。 本文研究結果為建立異東莨菪內酯和東莨菪內酯的分析方法奠定了基礎, 也為研究其他香豆素類化合物的熒光性質提供了參考。

圖1 異東莨菪內酯(a)和東莨菪內酯的分子結構(b)Fig.1 Molecular structures of isoscopoletin (a) and scopoletin (b)

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

F-7100熒光分光光度計( Hitachi ), 配備150 W氙燈, 1 cm熒光池, UV-30濾光片, 選擇激發和發射狹縫( slit )為5.0 nm, 光電倍增管負高壓(PMT )為700 V; UV-TU-1950紫外-可見分光光度計, 1 cm吸收池; Starter-3100型pH/ISE測試儀( Ohaus ); 十萬分之一分析天平( Mettler toledo )。

異東莨菪內酯( isoscopoletin, 98.1%, PS2208-0020MG, 成都普思生物科技股份有限公司): 在100 mL 的容量瓶中, 準確稱取0.010 30 g 異東莨菪內酯溶于100 mL甲醇中, 得到濃度103.0 mg/L的儲備液, 用時用水或甲醇稀釋。 東莨菪內酯( scopoletin, 98.1%, RUGS-2SB6, 中國食品藥品檢定研究院): 在100 mL 的容量瓶中,準確稱取0.009 30 g 東莨菪內酯溶于100 mL甲醇中, 得到濃度93.0 mg/L的儲備液, 用時用水和甲醇適當稀釋。 Britton-Robinson緩沖溶液: 將磷酸、硼酸和乙酸混合溶液(濃度均為0.40 mol/L)與NaOH溶液(1.0 mol/L)以一定比例混合, 用于調節pH; 硫酸奎寧( 生化試劑, 麥克林 ): 以0.05 mol/L的硫酸溶液配制成1.00×10-5mol/L溶液; 甲醇( 色譜純, TEDIA ), 所用酸堿試劑均為分析純或優級純, 實驗用水為二次去離子水。

1.2 實驗方法

對吸收光譜的影響 在一系列10 mL容量瓶中, 加入異東莨菪內酯或東莨菪內酯溶液, 以緩沖溶液調節不同的pH, 以水定容, 搖勻, 分別掃描溶液的吸收光譜。

對熒光光譜的影響 在一系列10 mL容量瓶中, 加入異東莨菪內酯或東莨菪內酯溶液, 以緩沖溶液調節不同的pH, 以水定容, 搖勻, 分別掃描溶液的熒光光譜。

溶劑對熒光光譜的影響 在一系列10 mL容量瓶中, 分別加入異東莨菪內酯或東莨菪內酯溶液和不同體積的甲醇, 以水定容, 搖勻, 分別掃描熒光光譜。

三維熒光圖譜的繪制 在一系列10 mL容量瓶中, 加入異東莨菪內酯或東莨菪內酯溶液, 以緩沖溶液調節溶液的pH, 以水定容, 搖勻。 分別測定中性條件、堿性條件下的三維熒光圖譜, 以水激發波長350 nm的熒光強度為對照繪制三維圖。

熒光量子產率的測定 在25 mL容量瓶中加入適量硫酸奎寧溶液, 以0.05 mol/L H2SO4溶液定容, 搖勻; 掃描紫外吸收光譜和熒光光譜, 測量激發波長處的吸光度和積分熒光強度, 以硫酸奎寧在激發波長313 nm的熒光量子產率0.55 為參比, 計算異東莨菪內酯或東莨菪內酯待測物質的熒光量子產率[19]。

2 結果與討論

2.1 pH對異東莨菪內酯水溶液吸收光譜的影響

考查了異東莨菪內酯水溶液在不同pH條件下的紫外-可見吸收光譜, 結果如圖2在pH 2.22～6.24區間, 異東莨菪內酯溶液分別在波長295、345 nm附近出現吸收峰, 295 nm的吸收峰比較弱,345 nm的吸收較強 (見圖2a) , 在酸性至中性條件下, 異東莨菪內酯紫外吸收光譜的峰型沒有變化, 這一光譜對應于分子型體; 在pH 6.93～10.56區間, 隨pH升高, 紫外光譜發生顯著變化, 吸收峰分別在波長248、309、388 nm附近出現吸收峰, 248 nm處的吸收強度隨著pH變大迅速增強, 為強吸收, 295 nm紅移至309 nm, 吸收強度比較弱, 345 nm吸收強度快速降低, 逐漸紅移至388 nm, 由于不同波長的吸光度值變化不同, 分別在235、286、300、317、368 nm波長處出現等色點 (見圖2b) , 吸光度隨著pH變化呈現離子電離時常見的S曲線 (見圖2d) , 在中性至弱堿性條件下, 這一光譜變化對應于6位-OH質子的電離, 當pH為10.11～11.49時, 388 nm吸收峰的強度不再變化, 說明6位-OH質子全部電離; 當pH為11.49～12.50時, 波長248、388 nm的吸收強度迅速下降, 309 nm吸收峰藍移至298 nm (見圖2c) , 強堿條件下, 這一光譜變化對應于內酯水解開環, 詳見圖3。

根據圖2(d)中的光譜數據, 可以用pH-分光光度法[20]計算異東莨菪內酯6-OH質子的電離常數 pKa= 9.14 ± 0.02。

2.2 pH對東莨菪內酯水溶液吸收光譜的影響

考察了東莨菪內酯水溶液在不同pH條件下的紫外-可見吸收光譜, 結果如圖4。 在pH 2.25～6.05區間, 東莨菪內酯在波長295、340 nm附近出現吸收峰, 340 nm的吸收峰較強 (見圖4a) 。 溶液從酸性至中性條件下, 吸收光譜的峰型幾乎沒有變化, 這一光譜對應東莨菪內酯分子型體的吸收峰; 在pH 6.51～10.53區間, 隨pH升高, 295、340 nm波長的吸光度值逐漸降低, 340 nm波長逐漸紅移至波長386 nm附近, 由于不同波長的吸光度值變化不同, 在235、280、354 nm波長附近出現等色點 (見圖4b) , 這一光譜變化對應于7位-OH質子的電離, 隨著pH升高, 386 nm吸收峰的強度逐漸增強。 當pH為9.94～10.53時, 386 nm吸收峰的強度不再變化, 說明7位-OH質子全部電離。 當pH > 10.70時, 386 nm吸收峰的強度逐漸降低, 在261 nm處出現吸收峰, 這一光譜變化對應于東莨菪內酯的內酯水解開環, 詳見圖5。

圖2 pH對異東莨菪內酯吸收光譜的影響 (a, b, c) 和吸收強度與pH的關系(d)Fig.2 Absorption spectra of isoscopoletin at different pHs (a, b, c) and the relationship between absorption intensity and pH (d)

圖3 異東莨菪內酯的電離和水解反應Fig. 3 Hydrolysis and dissociation reactions of isoscopoletin

圖4 pH對東莨菪內酯吸收光譜的影響(a, b, c)和吸收強度與pH的關系(d)Fig.4 Absorption spectra of scopoletin at different pHs (a, b, c) and the relationship between absorption intensity and pH (d)

圖5 東莨菪內酯的電離和水解反應Fig. 5 Hydrolysis and dissociation reactions of scopoletin

同法計算東莨菪內酯7-OH質子的電離常數 (pKa) 為7.50 ± 0.02, 與文獻[17]報道的解離常數 (pKa= 7.44 ± 0.01) 結果基本一致。

異東莨菪內酯和東莨菪內酯為位置同分異構體。 二者分子型體的吸收峰峰形基本一致, 異東莨菪內酯最大吸收峰的波長紅移5 nm, 說明羥基和甲氧基位置互換, 對分子型體的吸收光譜影響不顯著; 當羥基解離成離子型體, 最大吸收峰的波長接近, 但兩種型體的吸收峰數目和位置均不同; 內酯開環的水解產物吸收峰的數目和位置也不同, 說明羥基和甲氧基位置互換對離子型體和水解產物的吸收光譜影響顯著。 異東莨菪內酯和東莨菪內酯離子型體吸收光譜的差異性主要與羥基所處的位置有關, 7-OH解離后得到的氧負離子離域到苯并吡喃酮環, 形成的n-π共軛程度大, 離子型體更穩定, 7-OH中O與H之間的結合力弱, 測定的解離常數小, 所以更容易解離; 異東莨菪內酯的6-OH, 受到分子結構的影響, O與H之間的結合力相對較強, 解離常數比較大, 不易解離。 綜上, 異東莨菪內酯和東莨菪內酯吸收峰的差異與羥基所處的位置有關, 可以根據二者在堿性條件下吸收光譜的差異進行化合物的鑒別。

2.3 pH對異東莨菪內酯水溶液熒光的影響

分別測定了中性和堿性條件下異東莨菪內酯的三維熒光圖譜, 見圖6。

圖6 異東莨菪內酯中性溶液(a)和堿性溶液溶液(b)的三維熒光圖譜Fig.6 3D fluorescence spectra of isoscopoletin in neutral solution (a) and alkaline solution (b)

在中性條件下,異東莨菪內酯的激發峰(λex)分別為230、290、340 nm, 發射峰 (λem) 均為435 nm, 為分子型體的熒光峰。 在堿性條件下, 異東莨菪內酯的激發峰分別為230、288、356 nm, 發射峰均為450 nm, 為離子型體的熒光峰。

分別測定了溶液酸堿度對異東莨菪內酯分子型體和離子型體熒光光譜的影響, 見圖7和圖8。

圖7 pH對異東莨菪內酯(分子型體)熒光光譜的影響(a, b)和熒光強度與pH的關系 (c)Fig.7 Fluorescence spectra of isoscopoletin (molecular form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

圖8 pH對異東莨菪內酯(離子型體)熒光光譜的影響 (a, b) 和熒光強度與pH的關系 (c)Fig.8 Fluorescence spectra of isoscopoletin (ionic form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

由圖7可知, 異東莨菪內酯水溶液分子型體的熒光峰峰形沒有變化, 只是熒光強度隨著溶液pH的變化而呈現有規律的變化。 當pH 2.07～ 6.30, 異東莨菪內酯水溶液的熒光強度最強且穩定; 當pH 7.29～ 11.90, 隨著pH逐漸升高, 分子型體的熒光強度逐漸降低, 6-OH的氫質子開始解離; 當pH >12.0, 異東莨菪內酯的熒光強度很弱, 335 nm的激發峰基本消失, 發射峰波長逐漸紅移, 發射峰紅移至456 nm, 內酯環發生斷裂開環。 以硫酸奎寧為參比, 在激發波長340 nm處，測得異東莨菪內酯分子型體 (pH = 5.87) 的熒光量子產率為0.15。

由圖8可知, 異東莨菪內酯水溶液離子型體的熒光峰隨著溶液pH的變化而呈現有規律的變化。

當pH 2.07～ 9.12, 異東莨菪內酯水溶液的熒光強度變化不大, 激發峰和發射峰的波長逐漸紅移; 隨著pH逐漸升高, 6-OH開始解離, 異東莨菪內酯分子型體的熒光強度逐漸增強, 當pH為10.16附近時, 熒光強度達到最強, 最大激發和發射波長分別為356 nm和450 nm; 當pH >10.95, 激發峰和發射峰逐漸紅移, 當pH >11.97, 激發峰紅移至378 nm, 發射峰紅移至460 nm, 這對應著水解產物的光譜變化。 以硫酸奎寧為參比, 在激發波長356 nm處，測得異東莨菪內酯離子型體 (pH = 9.26) 的熒光量子產率為0.29。

2.4 pH對東莨菪內酯水溶液熒光的影響

分別測定了中性和堿性條件下東莨菪內酯的三維熒光圖譜, 如圖9。

圖9 東莨菪內酯中性溶液(a)和堿性溶液(b)的三維熒光圖譜Fig.9 3D fluorescence spectra of scopoletin in neutral solution (a) and alkaline solution (b)

在中性條件下, 東莨菪內酯的激發峰為230、290、340 nm, 發射峰均為460 nm, 為分子型體的熒光峰。 在弱堿性條件下, 東莨菪內酯的激發峰為230 nm和378 nm, 發射峰均為460 nm, 為離子型體的熒光峰。

分別測定了溶液酸堿度對東莨菪內酯分子型體和離子型體熒光的影響, 見圖10和圖11。

由圖10可知, 當pH > 2.04, 隨著pH升高, 東莨菪內酯溶液的熒光逐漸增強, 當pH為5.27～6.52時, 熒光達到最強且穩定, 這是分子型體的熒光峰 (λex/λem:340/460 nm)，與文獻[18]中測定熒光峰 (λex/λem:343/462 nm)基本一致; 當pH > 6.52,東莨菪內酯水溶液的熒光強度隨pH升高而逐漸降低, 激發波長從340 nm紅移至378 nm, 發射波長460 nm沒有變化, 7-OH逐漸電離, 逐漸形成離子型體; 當pH為 11.83～13.0時, 熒光降低且基本穩定。 以硫酸奎寧為參比, 在激發波長340 nm處, 測得東莨菪內酯分子型體 (pH = 6.02) 的熒光量子產率為0.48。

由圖11可知, 當pH為1.87～5.81時, 熒光比較弱, 熒光強度變化不大; 當pH>6.37 , 東莨菪內酯溶液的熒光隨著pH變大而迅速增強, 當pH在9.21～10.89區間, 熒光達到最強而穩定, 這一熒光對應著離子型體的熒光(λex:378 nm) ，與文獻[18]測定的激發峰 (λex:388 nm)有差異，可能與樣品、儀器等多種因素有關，但是熒光強度隨pH變化的趨勢基本一致; 當pH >11.76,東莨菪內酯水溶液的熒光強度隨pH升高而逐漸降低, 激發波長和發射波長 (λex/λem:378 /460 nm) 沒有變化, 內酯環水解發生開環反應。 以硫酸奎寧為參比, 在激發波長378 nm處, 測得東莨菪內酯陰離子的弱堿性溶液 (pH = 9.58) 熒光量子產率為0.65, 為強熒光物質, 比文獻[21]報道的熒光量子產率略低 (Yf: 0.71) 。

圖10 pH對東莨菪內酯(分子型體)熒光光譜的影響 (a, b) 和熒光強度與pH的關系 (c)Fig.10 Fluorescence spectra of scopoletin (molecular form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

圖11 pH對東莨菪內酯(離子型體)熒光光譜的影響 (a, b) 和熒光強度與pH的關系 (c)Fig.11 Fluorescence spectra of scopoletin (ionic form) at different pHs (a, b) and the relationship between fluorescence intensity and pH (c)

在中性條件下, 異東莨菪內酯的最大激發峰和發射峰 (λex/λem) 為340 /435 nm, 東莨菪內酯的最大激發峰和發射峰 (λex/λem) 為340/460 nm, 東莨菪內酯比異東莨菪內酯的發射峰波長紅移了約25 nm; 在堿性條件下, 異東莨菪內酯的最大激發峰和發射峰 (λex/λem) 為356/450 nm, 東莨菪內酯的最大激發峰和發射峰(λex/λem) 為378/460 nm, 東莨菪內酯比異東莨菪內酯的激發峰紅移了約22 nm, 發射峰紅移了約10 nm。 東莨菪內酯接近pH=12時開始水解，異東莨菪內酯接近pH=11時開始水解，文獻 [21]指出內酯環強堿水解反應的速率與C-7位取代基的性質有關，當有羥基存在，可使羰基碳難以接受OH-的親核反應，所以東莨菪內酯 (7-OH) 比異東莨菪內酯 (7-OCH3) 更難于水解。測定結果表明, 東莨菪內酯分子型體和離子型體的熒光量子產率比相應的異東莨菪內酯都大。 基于此, 東莨菪內酯的分子型體和離子型體的熒光峰比東莨菪內酯的波長更長, 因此形成的共軛體系更穩定。

2.5 溶劑對異東莨菪內酯和東莨菪內酯溶液熒光的影響

在近中性條件下, 考察了溶劑 (水溶液中甲醇的體積分數) 對異東莨菪內酯和東莨菪內酯溶液熒光的影響, 結果見圖12和圖13。

c: 1.03 mg/L, λex/λem: 340/435 nm圖12 甲醇對異東莨菪內酯熒光光譜(a)和熒光強度的影響(b)Fig.12 Influence of methanol on fluorescence spectra(a) and fluorescence intensity of isoscopoletin(b)

c: 9.3 μg/L, λex/λem:340/460 nm圖13 甲醇對東莨菪內酯熒光光譜(a)和熒光強度的影響(b)Fig.13 Influence of methanol on fluorescence spectra (a) and fluorescence intensity of scopoletin(b)

由圖12可知, 異東莨菪內酯溶液中隨著甲醇體積分數的增加, 最大激發波長和最大發射波長均未發生變化, 但是熒光強度隨著甲醇的含量增加而大大增強。 說明甲醇溶劑對熒光的影響比較大, 這是甲醇的溶劑化效應, 甲醇溶劑環境使異東莨菪內酯的分子結構穩定, 從而使熒光強度增強。 基于此, 測定異東莨菪內酯溶液熒光時, 溶液中甲醇的含量保持一致。

由圖13可知, 東莨菪內酯溶液中隨著甲醇體積分數的增加, 最大激發波長未發生變化, 最大發射波長從457 nm藍移到417 nm, 熒光強度迅速降低, 甲醇的含量對東莨菪內酯熒光的影響比較大。 甲醇所形成的微環境, 不利于東莨菪內酯分子結構穩定, 從而使熒光強度迅速降低。 因此, 測定東莨菪內酯溶液熒光時, 甲醇的含量不能超過20%。

3 結論

異東莨菪內酯和東莨菪內酯是一對同分異構體, 在不同條件下(酸堿度、溶劑)吸收光譜和熒光光譜具有顯著差異。 吸收光譜中, 異東莨菪內酯和東莨菪內酯分子型體的紫外吸收光譜基本一致, 羥基解離后離子型體的吸收光譜波長和峰形差異性比較大, 解離分數表明異東莨菪內酯 (6-OH, pKa= 9.14 ± 0.02) 不容易解離, 東莨菪內酯相對容易解離 (7-OH, pKa= 7.50 ± 0.02); 在強堿性條件下, 分子結構中內酯環水解, 二者的紫外吸收光譜同樣具有明顯的差異性。 熒光光譜中, 異東莨菪內酯和東莨菪內酯的分子型體都具有熒光, 激發波長基本一致, 東莨菪內酯的發射波長紅移; 異東莨菪內酯和東莨菪內酯的離子型體也具有熒光, 但是東莨菪內酯的最大激發波長和發射波長有不同程度的紅移, 說明東莨菪內酯分子共軛程度高。 溶劑對二者的熒光光譜和熒光強度影響不同, 隨著甲醇含量的增加, 東莨菪內酯的激發波長不變,發射波長發生藍移, 熒光強度逐漸減弱, 而異東莨菪內酯僅熒光強度隨之迅速增強。 異東莨菪內酯和東莨菪內酯的紫外光譜和熒光光譜的差異性與分子結構中羥基所處位置有關, 羥基在6位和7位電離后所形成的n-π共軛體系具有差異性。 利用異東莨菪內酯和東莨菪內酯吸收光譜和熒光光譜的差異性, 可以為中藥材中二者的分別定量分析提供研究基礎。