骨橋蛋白介導細胞自噬在小鼠低氧性肺動脈高壓形成中的作用及機制#

李 苒，劉川川，劉瑞欣，陳辛玲，丁 琦，張先平，吳鵬厚，嚴曉成，王生蘭*

(1.青海大學基礎醫學部；2.青海大學高原醫學研究中心；3.青海大學臨床學院)

骨橋蛋白(Osteopont，OPN)是心血管疾病的危險因素之一，也是新近發現的潛在的治療靶點[1]?，F有研究表明，慢性缺氧使肺中OPN表達上調，而OPN可以通過多個途徑來調節細胞自噬，影響肺動脈高壓(PAH)的形成[2]。本文擬探討骨橋蛋白介導細胞自噬在低氧環境下對小鼠低氧性肺動脈高壓(HPH)形成的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

1.1.2 儀器與試劑

低壓氧艙(西安富康空氣凈化設備工程有限公司)，BL-420S 生物采集系統(埃德儀器國際貿易上海有限公司)，RS36型全自動染色機(常州派斯杰醫療設備有限公司)，數字切片掃描儀(濟南丹吉爾電子有限公司)，透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)；OPN抗體(美國Abcam公司)，Beclin-1一抗、LC3B一抗、p38MAPK抗體、PI3K抗體、NF-κB抗體(美國Abcam公司)，辣根酶標記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理

將小鼠分為常氧對照組(n=7)、常氧合并OPN-/-組(n=7)、低氧對照組(n=7)、低氧合并OPN-/-組(n=7)。低氧組置低壓氧艙(模擬海拔5000m)28 d。常氧組飼養21 d后取材，低氧組飼養28 d后取材。

1.2.2 小鼠肺動脈壓的測定

向腹腔內注射4%水合氯醛(0.1mL/10g)，用鑷子輕夾小鼠的腳趾，無反應表示進入深度麻醉狀態。小鼠仰臥固定于鼠臺，沿頸部正中切口，分離出右側頸外靜脈，將聚乙烯微導管從右頸外靜脈插入右心室或肺動脈，另一端連接在BL-420S生物壓力傳感器上，描記5 min的肺動脈壓曲線。

《意見》按照“河長負責、分工協作；統籌兼顧、分步實施；建管并重、強化管理；上下聯動、協調配合；屬地為主、以獎代補”五個基本原則，提出了2013年、2015年和2020年三個階段管理目標以及加強截污治污和水資源保護、加強堤岸水面保潔和違章建筑清理、加強河道綠化和景觀建設、建立長效管理機制四項主要任務。

1.2.3 小鼠右心室肥厚指數的測量

以脫臼法處死動物后，迅速取出心、肺組織，分別稱取右心室(Right Ventricle，RV)、左心室(Left Ventricle，LV)和室間隔(Interventricular Septum，S)的重量，計算右心室肥厚指數[RV/(LV+S)]。

1.2.4 小鼠肺組織形態學觀察

常規制片后做鏡檢并采集圖像。

1.2.5 小鼠肺動脈形態學觀察

常規制片后在電鏡下進行圖像采集，觀察具體病變。

1.2.6 mRNA的表達水平檢測

采用總RNA提取試劑盒提取肺組織中的RNA，反轉錄為cDNA。RT-PCR的總反應上樣量為20 μL，上機程序：①變性(95℃，30s，1cycle)；②定量(95℃，5s；60℃，30s。40cycle)；③融解(95℃，5s；60℃，1min；95℃。1cycle)；④降溫(50℃，30s。1cycle)。檢測各組肺組織中OPN、p38MAPK、PI3K、NF-κB以及自噬相關蛋白LC3B、Beclin-1的mRNA表達水平。

1.2.7 蛋白表達量檢測

肺組織蛋白提?。簩颖救〕龊箅x心1 min(4℃，12000r/min)；加入蛋白裂解液，在冰上靜置30 min，離心5 min(4℃，12000r/min)；用移液槍吸取上層水相轉移至新EP管中，提取一部分使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，根據蛋白濃度加入5×Load Buffer和H2O，煮(100℃)5 min后置-20 ℃冰箱保存。蛋白印跡法實驗：①制備凝膠：用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備凝膠，OPN、LC3B、Beclin-1采用12%的分離膠，p38MAPK、PI3K、NF-κB采用10%的分離膠，OPN、LC3B、Beclin-1、p38MAPK、PI3K、NF-κB采用5%的濃縮膠；②加樣：左右孔各加入8 μL的maker，左右孔中間蛋白上樣量為10 μL；③電泳(90v)：距離膠底2 cm處停止電泳；④轉膜(180mA)時間：β-actin、OPN、LC3B、Beclin-1轉膜時間為60 min，p38MAPK、PI3K、NF-κB轉膜時間為90 min；⑤切膠：根據分子量大小選擇合適的范圍；⑥封閉：以脫脂牛奶搖床封閉1 h；⑦孵一抗：置4 ℃冰箱過夜；⑧洗一抗：用1×TBST洗3次，每次10 min；⑨孵二抗：在搖床上封閉1 h，用TBST洗3次；⑩顯影曝光：配置曝光液，滴在PVDF膜上。

1.2.8 統計學處理

2 結果

2.1 低氧及OPN對mPAP、RVHI的影響

低氧環境下mPAP、RVHI呈增高趨勢(P<0.05)，且OPN-/-組的mPAP、RVHI低于對照組(P<0.05)。(表1)

表1 四組小鼠mPAP和RVHI

2.2 肺組織形態學變化

觀察100倍和400倍圖片，結果顯示，常氧對照組肺組織未見明顯病理改變(圖1)；常氧合并OPN-/-組肺間質見少量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和淋巴細胞為主，并可見出血或少量紅細胞溢出(圖2)；低氧對照組見少量肺泡上皮細胞壞死，胞核固縮崩解，肺間質被少量炎性細胞浸潤，可見漿細胞，病理改變相對較重(圖3)；低氧合并OPN-/-組肺間質見少量炎性細胞浸潤，以細胞較小、胞核偏于一側的漿細胞為主(圖4)。

圖1 常氧對照組肺組織HE染色圖(A：100×，B：400×)

圖2 常氧合并OPN-/-組肺組織HE染色圖(C：100×，D：400×)

圖3 低氧對照組肺組織HE染色圖(E：100×，F：400×)

圖4 低氧合并OPN-/-組肺組織HE染色圖(G：100×，H：400×)

2.3 肺動脈形態學變化

觀察透射電鏡圖片，結果顯示：常氧對照組電鏡下血管內皮細胞和平滑肌細胞形態結構均較正常，胞漿內各細胞器完整清晰，未見明顯病變(圖5)；常氧合并OPN-/-組血管內皮細胞形態結構較正常，但部分血管內皮細胞胞漿內見少量空泡，多數平滑肌細胞形態結構較完整清晰，偶見核周隙增寬的平滑肌細胞(圖6)；低氧對照組樣本結構破壞較嚴重，僅見斷裂的血管和少量殘存的膠原纖維，其中血管內皮細胞已發生壞死，細胞膜變得不連續，胞漿內容物丟失且見少量空泡(圖7)；低氧合并OPN-/-組血管內皮細胞形態結構較正常，胞漿內各細胞器清晰完整，吞飲小泡豐富，可見少量自噬小體形成，部分平滑肌細胞內的肌纖維溶解(圖8)。

A：血管內皮細胞(↑)，平滑肌細胞(↑)，膠原纖維(↑)，紅血球(↑)

C：核周隙增寬(↑)的平滑肌細胞(↑)，血管內皮細胞(↑)，緊密連接(↑)

E：細胞核(N)、線粒體(Mi)、粗面內質網(RER)、空泡(↑)，緊密連接(↑)，膠原纖維(↑)

G：自噬(↑)，膠原纖維(↑)，緊密連接(↑)，紅血球(↑)

2.4 低氧對OPN、Beclin-1、LC3B mRNA表達水平的影響

與常氧組相比，低氧下OPN、Beclin-1、LC3B的mRNA表達水平增高(P<0.05)，與對照組比，OPN-/-組OPN的mRNA表達水平降低(P<0.05)，而Beclin-1、LC3B的mRNA表達水平增高(P<0.05)。(表2)

表2 低氧對自噬相關基因mRNA表達的影響值

2.5 低氧及OPN對p38MAPK、PI3K、NF-κB mRNA表達水平的影響

與常氧組比，低氧下p38MAPK、PI3K、NF-κB的mRNA表達水平增高(P<0.05)，與對照組比，OPN-/-組p38MAPK、PI3K、NF-κB的mRNA表達水平降低(P<0.05)。(表3)

表3 低氧對p38MAPK、PI3K、NF-κB的mRNA表達的影響值

2.6 低氧對OPN、Beclin-1、LC3B蛋白表達水平的影響

低氧處理能明顯增高OPN的表達水平(P<0.05)，自噬相關蛋白Beclin-1、LC3B的表達水平也增高(P<0.05)；OPN-/-組的OPN的表達水平明顯降低(P<0.05)，引起自噬相關蛋白Beclin-1、LC3B的表達水平增高(P<0.05)。(圖9，表4)

圖9 四組小鼠OPN及自噬蛋白凝膠電泳圖

表4 低氧對OPN、Beclin-1、LC3B蛋白表達的影響

2.7 低氧及OPN對p38MAPK、PI3K、NF-κB蛋白水平表達的影響

與常氧組比，低氧下p38MAPK、PI3K、NF-κB蛋白的表達水平增高(P<0.05)；OPN-/-組的p38MAPK、PI3K、NF-κB蛋白的表達水平降低(P<0.05)(圖10，表5)。

圖10 四組小鼠p38MAPK、PI3K、NF-κB的凝膠電泳圖

表5 低氧對p38MAPK、PI3K、NF-κB蛋白表達的影響

3 討論

參與PAH形成的生物學機制是復雜的，目前尚未完全闡明，大量研究表明，慢性缺氧是PAH發生發展的一個關鍵因素[3-4]。HPH是一種常見的類型，血管重構是其發生發展的重要病理過程[5-6]。新生內膜形成、異常肌化和肺外膜增厚、閉塞性改變及叢狀病變是血管重塑的主要病理特征[7]。本研究通過檢測小鼠在模擬5 000米海拔低壓低氧環境下的mPAP及RVHI，推測低氧環境可以導致PAH的形成。

OPN是一種磷酸化的糖蛋白[8]，存在于成骨細胞、破骨細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞、內皮細胞和心肌細胞等細胞[9]。OPN可促進細胞的增殖、遷移和侵襲，并且通過不同途徑來調節細胞自噬的過程[2，10]。有研究報道OPN在野百合堿和缺氧誘導的PAH大鼠和小鼠的肺和肺動脈中表達上調[2，10]。這和我們的研究結果一致。在缺氧持續存在的情況下，OPN的持續升高可導致肺動脈平滑肌細胞增殖、肺血管重構，參與HPH的發生[11]。

研究表明自噬小體的形成是由Beclin-1(酵母中Atg6)和LC3啟動的，它們參與PAH的肺血管重構的調節[12]。Beclin-1、LC3B是自噬小體形成過程中的主要標記物[12]，因此可以作為監測自噬活動的指標。我們研究發現，在低氧誘導的PAH動物模型的肺組織中，自噬相關蛋白Beclin-1和LC3B的表達增加，與其他學者的研究結果不謀而合[13]。

OPN可以通過調控自噬來影響疾病的發生發展，在不同組織器官中，OPN對自噬的調控作用具有雙向性，OPN既可以促進自噬發生，也可以抑制自噬發生[14-15]。并且OPN可能通過多種信號轉導通路調控細胞自噬。p38MAPK是ROS下游的重要效應因子之一，參與心肌肥大和自噬的調節[16]。有研究表明，p38抑制自噬，促進凋亡，但自噬是否誘導或抑制凋亡取決于細胞類型以及刺激的性質和持續時間[17]。Zheng等人研究發現，p38MAPK參與了OPN誘導的血管平滑肌細胞自噬[18]，p38MAPK可以磷酸化ULK1并破壞ULK1/ATG13復合物，抑制自噬[19]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條被廣泛研究的經典通路，它在轉錄、翻譯、代謝中發揮著關鍵作用，并調節一系列細胞過程，包括細胞增殖、自噬、凋亡等[20]。OPN通過PI3K信號通路加速內皮細胞的血管生成[21]，敲低OPN后抑制由αvβ3誘導的細胞增殖和遷移，通過誘導自噬而使PI3K/Akt/mTOR途徑失活[22]。NF-κB是一種轉錄因子，在活性氧存在時被表達，隨后自噬途徑被激活[23]。NF-κB蛋白家族中有五種轉錄因子(p65/RelA、RelB、c-Rel、NF-kB1/p50和NF-κB/p52)[24]，在誘導后調節不同靶基因的表達，參與許多生理反應，包括免疫炎癥、急性炎癥、氧化應激反應和細胞粘附、分化和凋亡反應[25]。OPN可以通過NF-κB信號通路誘導自噬，減少活性氧的產生及DNA的損傷[26-27]，并且OPN通過激活PI3K信號通路，上調Bcl-xL，激活NF-κB，從而為細胞提供保護作用[28]。與這些研究結果一致，我們研究發現，低氧使肺組織中OPN的表達增多，p38MAPK、PI3K、NF-κB的表達上調，當敲除OPN基因后，p38MAPK、PI3K、NF-κB的表達減少。

綜上所述，我們證實慢性低氧可以促進肺組織中OPN的表達，促進自噬相關蛋白的表達，促進自噬的發生，致p38MAPK、PI3K、NF-κB信號蛋白的表達水平增高；當敲除OPN基因后，自噬蛋白Beclin-1、LC3B表達顯著增高，說明OPN對自噬具有抑制作用，而p38MAPK、PI3K、NF-κB表達減少，推測OPN可能通過p38MAPK、PI3K、NF-κB信號通路抑制自噬的發生，進而參與PAH的發生發展。但是OPN到底是通過哪條途徑以及機制參與PAH的形成還需進一步研究。