鴿新城疫病毒Ⅵ-HZ株的分離鑒定及其遺傳進化分析

錢 晶，劉 雪，王 瑋，周紅波，王永山*

(1.江蘇省農業科學院 獸醫研究所 農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.仲愷農業工程學院 動物科技學院 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510225；3.華中農業大學 動物醫學院 農業微生物學國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強毒株引起禽的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，給養禽業造成巨大經濟損失。世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties，OIE)將其列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1-2]。NDV屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、正禽腮腺炎病毒屬(Orthoavulavirus)，為單鏈負股、不分節段、有囊膜的RNA病毒，直徑大小為100～400 nm，其基因組共編碼6個結構蛋白和2個非結構蛋白，基因排列方式為3′-NP-P/V/W-M-HN-F-L-5′[3]。根據F基因的遺傳序列分析，可將NDV分為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，每類又可進一步分為多種基因型或基因亞型，其中ClassⅡ類至少包括20個基因型[4]。近年來，鴿ND零星散發，病死率居高不下，從病死鴿中分離的NDV多為ClassⅡ類的基因Ⅵ型毒株[5-10]，該基因型毒株與商品疫苗株(基因Ⅱ型和基因Ⅶ型等毒株)存在明顯抗原性差異，防控難度較大。

為了解江蘇地區鴿NDV的分子流行病學情況，本研究從江蘇某鴿場疑似ND病鴿中分離并純化NDV，測定其致病性指標，通過獲取病毒全基因組序列，分析核苷酸同源性和主要結構蛋白分子特征，繪制F基因系統發育進化樹，分析其遺傳進化情況，為本地區的鴿源NDV的分子流行病學調查提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 病料、細胞、動物與主要試劑病料樣品來源于2017年江蘇省淮安市洪澤區某鴿場疑似ND病鴿；雞胚成纖維細胞系(DF-1)由本實驗室保存；9日齡SPF雞胚購自兆豐華生物科技(南京)有限公司；30日齡非免(NDV抗體陰性)草鴿購自山東高翔肉鴿養殖場；病毒核酸提取試劑RNAiso Plus(Code No.9108)、反轉錄試劑PrimeScriptTMⅥ 1st strand cDNA Synthesis Mix(Code No.6215A)、Premix TaqTM(Code No.R004A)、TB Green?Fast qPCR Mix(Code No.RR420Q)、感受態細胞DH5α(Code No.9057)、pMDTM19-T載體(Code No.6013)購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；NDV血凝抑制試驗抗原/陽性血清、禽流感病毒H5、H7和H9亞型血凝抑制試驗抗原/陽性血清購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.2 病毒的分離培養與鑒定將病料研磨后用無菌PBS重懸，8 000 r/min離心5 min，取上清經0.45 μm 過濾后按常規方法接種9日齡SPF雞胚，每日觀察雞胚死亡情況，棄24 h內死亡胚，未死亡的雞胚于接種5 d后無菌收集雞胚尿囊液，對其進行血凝(HA)試驗和血凝抑制(HI)試驗，樣品HA和HI效價高于或等于4 log2，且不與禽流感病毒血凝抑制試驗抗體反應，視為NDV陽性。將病毒接種至DF-1細胞單層，進行3輪空斑純化，純化的病毒在9日齡SPF雞胚上連續傳3代，直至HA效價穩定，保存-70℃備用。

1.3 病毒的毒力指標測定與致病性分析根據OIE標準測定病毒的MDT(雞胚平均致死時間)、ICPI(1日齡雛雞腦內接種致病指數)以及EID50(雞胚半數感染量)。30只試驗鴿隨機分為3組(試驗組、同居組、對照組)，每組10只，每只均標有腳標，試驗組以肌注方式接種0.1 mL 105EID50的病毒量，同居組不接種病毒但與試驗組同居飼養，對照組以肌注方式接種0.1 mL滅菌生理鹽水，每天記錄鴿臨床表現，繪制存活率曲線；攻毒后在第3，5，7，10和14天分別取泄殖腔棉拭子，采用熒光定量PCR法檢測其排毒情況；對病死鴿進行解剖，采用HE染色法對鴿主要臟器進行處理，分析臟器病理組織學變化。

1.4 病毒全基因組測序與F基因序列分析參考多株鴿NDV序列，設計11對引物(表1)，按照試劑盒說明書提取病毒基因組并反轉錄成cDNA，利用PCR法分段擴增，將產物連接至pMDTM19-T載體并轉化DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，引物合成與測序均由通用生物系統(安徽)有限公司完成。使用DNAStar lasergene 8.0和SnapGene 2.3.2軟件對全基因組序列進行拼接并將其上傳至GenBank數據庫。選取20株參考株序列，利用MEGA 7.0軟件分析全基因組核苷酸同源性，基于F基因全長序列，通過最大似然算法(Maximum Likelihood，ML)，使用GTR+I+R參數模型，Bootstrap值設定為500次重復繪制系統進化樹。

表1 病毒全基因組測序用引物

2 結果

2.1 病毒的鑒定與毒力測定病料樣品接種雞胚后收集的雞胚尿囊液具有凝集雞紅細胞活性，其HA效價為6 log2，該樣品能與NDV血凝抑制試驗陽性血清發生反應，不與禽流感病毒H5、H7和H9亞型血凝抑制試驗陽性血清發生反應；通過空斑純化后，獲得HA效價為8 log2的NDV，命名為NDV Ⅵ-HZ株。該毒株MDT為80 h，ICPI為1.2，EID50為107.0/0.1 mL，屬于中等毒力型NDV。

2.2 病毒對鴿致病性分析將Ⅵ-HZ株人工感染試驗鴿，觀察鴿群精神狀態、采食量與病死情況，連續觀察14 d。試驗組鴿群第5天采食量下降、第7天出現明顯流淚、扭頭、排水樣黃綠稀糞，死亡率為60%(6/10)(圖1)；同居組鴿群第10天出現明顯腹瀉和神經癥狀，死亡率50%(5/10)(圖1)；對照組鴿群采食正常、無臨床癥狀。病死鴿剖檢可見腦膜充血、水腫及腸道出血。病理切片結果顯示，試驗組病死鴿腦組織水腫，氣管纖毛脫落、黏膜下層出血，肺臟部分區域有大量炎癥細胞聚集，胃黏膜層正常、無病變，肝臟內有明顯的脂肪變性、淤血及灶狀的炎癥反應，小腸絨毛上皮細胞脫落壞死、黏膜固有層有炎癥反應，脾臟內有少量巨噬細胞聚集；同居組病死鴿腦組織水腫，氣管黏膜下水腫，肺臟內有炎性細胞浸潤及出血現象，胃黏膜層正常、無病變，肝臟內有少量淤血及灶狀的炎癥反應，小腸絨毛上皮細胞脫落壞死、黏膜固有層有炎癥反應，脾小體增生、動脈淋巴鞘增厚(圖2)；對照組鴿腦組織正常，氣管完整、黏膜層無明顯變化，肺臟正常，胃黏膜上皮結構完整，肝臟組織正常，小腸結構完整、無病變，脾臟正常(圖2)；這表明Ⅵ-HZ株能對鴿腦、腸造成損傷最為嚴重，其次為氣管、肺、肝臟和脾臟。試驗組鴿群泄殖腔棉拭子在第3天檢測到NDV核酸陽性，排毒高峰在第7天；同居組鴿群泄殖腔棉拭子在第7天檢測到NDV核酸陽性；對照組鴿群泄殖腔棉拭子并未檢測到NDV核酸(表2)。綜上表明，Ⅵ-HZ株對鴿具有較強致病性和傳播能力。

圖1 Ⅵ-HZ株感染鴿的存活曲線

圖2 Ⅵ-HZ株感染鴿的病理組織學觀察

表2 試驗鴿染毒后不同時間泄殖腔排毒檢測

2.3 病毒全基因組測序與分析通過分段PCR擴增得到11段1 200～1 700 bp的條帶，3′端leader和5′端trailer序列長度分別為55和114 nt，利用軟件拼接獲得Ⅵ-HZ株基因組(MW412840)，全長15 192 nt，排列方式為3′-NP-P/V/W-M-F-HN-L-5′，6個結構蛋白(NP、P、M、F、HN、L)基因開放閱讀框(ORF)序列長度分別為1 470,1 188,1 095,1 662,1 716 和6 615 bp，對應編碼氨基酸數分別為489，395，364，553，571和2 204個；由P基因通過“RNA”編輯產生2個非結構蛋白(V、W)基因ORF序列長度分別為720和684 bp，對應編碼氨基酸數分別為239和227個；Ⅵ-HZ株F蛋白裂解位點氨基酸序列為112KRQKRF117，具有NDV強毒的分子特征。

2.4 同源性和進化樹分析通過病毒全基因組序列核苷酸同源性分析，Ⅵ-HZ株與國內外鴿源分離株(國內鴿源分離株MW147626_Pigeon/BJ2018和國外鴿源分離株JN986839.1_Pigeon/IE/806/04)的同源性較高，分別為91.0%和92.8%，但與我國經典強毒F48E8株、英國經典強毒Herts33株、水禽源強毒NA-1株以及疫苗V4株、LaSota株、Mukteswar株同源性較低(83.6%～87.4%)(表3)?；贔基因系統發育進化樹可見，Ⅵ-HZ株位于ClassⅡ類基因Ⅵ型分支中，與Ⅵ.2.2.2型毒株親緣關系最近(圖3)。

表3 分離株與參考株核苷酸同源性分析

圖3 基于F基因核苷酸序列的系統進化樹

3 討論

鴿ND主要以腹瀉和神經癥狀為特征，對各品種鴿和各段齡鴿均易感，嚴重危害養鴿業健康發展。自1926年ND首次發現以來，世界上曾經歷過4次ND大流行，其中鴿源NDV被認為是第2，3次ND大流行的主要病因[1,3-4]。然而，由于缺少鴿專用ND疫苗，通常采用雞ND疫苗來預防，對鴿源NDV的保護效果不佳[11-12]，使得鴿ND疫情在我國部分地區(北京、天津、廣東、山東、江蘇等)經常發生[5-10,13-14]。

本研究于2017年從江蘇某鴿場分離到1株鴿源NDV(Ⅵ-HZ株)，根據OIE推薦的毒力判定標準，該毒株屬于中等毒力型，這與大多數鴿源NDV分離株的毒力相當[5-9,13-14]。然而，Ⅵ-HZ株F蛋白裂解位點卻表現為強毒分子特征(112KRQKRF117)，表明F蛋白裂解位點并非是適用于評價鴿源NDV毒力。動物回歸試驗結果表明，Ⅵ-HZ株可致鴿群出現典型腹瀉和神經癥狀，對鴿腦、腸造成損傷最為嚴重，其次為氣管、肺、肝臟和脾臟，與鴿場病死鴿的臨床癥狀相符；同居組也在隨后幾天出現排毒和臨床癥狀，表明Ⅵ-HZ株具有較強致病性和傳播能力。病毒排毒在感染第3天即可檢測到，而此時鴿群的臨床癥狀并未完全表現，提示在發現疑似或確診病例時及早進行干預，因此加強鴿NDV的日常監測對防控鴿ND尤為重要。

NDV只有一種血清型，DIEL等[15]基于F基因47～420 bp高變區進行遺傳進化分析，將ClassⅡ類中的基因Ⅵ型NDV劃分為Ⅵa、Ⅵb、Ⅵe、Ⅵf、Ⅵh、Ⅵj、Ⅵk、Ⅵn等多個亞型，我國主要流行Ⅵb亞型毒株。依據最新的NDV分類規則，ClassⅡ類基因Ⅵ型毒株可進一步劃分為至少7個基因亞型(Ⅵ.1、Ⅵ.2.1.1、Ⅵ.2.1.1.2.1、Ⅵ.2.1.1.2.2、Ⅵ.2.1.2、Ⅵ.2.2.1、Ⅵ.2.2.2)[4]，本研究分離的Ⅵ-HZ株屬基因Ⅵ.2.2.2亞型毒株，該亞型即為之前報道的Ⅵe亞型，與Ⅵb亞型(新分類為Ⅵ.1亞型)毒株有一定的遺傳距離，提示鴿源Ⅵ亞型毒株適應性進化以及多樣性需引起重視，摸清鴿源NDV分子流行病學情況十分必要。

綜上所述，本研究從江蘇地區病鴿中分離到1株鴿源NDV，與當前國內鴿源NDV流行株之間具有較高的同源性，該病毒對鴿具有較強致病性。同時，研究結果有助了解本地區鴿源NDV的遺傳進化情況，為后續開展鴿專用ND疫苗和生物防治產品研制奠定基礎。