2019—2020年河北部分地區雞源致病性大腸桿菌的血清型及毒力基因分布

張海龍，何云鳳，黨儒堯，陳 玥，李佩國，李蘊玉

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)病是一種引起雞腹瀉、腸炎、輕度至重度敗血癥等相關的綜合征[1]。E.coli通過土壤、空氣、食物等多種途徑傳播[2]，該病分布廣、呈世界性流行，常與傳染性支氣管炎、新城疫等呼吸道疾病及球蟲病并發[3]，可感染雛雞、育成雞、產蛋雞、肉雞等在不同季節發病，具有較高的病死率，是養雞場最常見的細菌病之一[4-5]。雞E.coli血清型眾多，主要包括O抗原、K抗原、H抗原3種，而O抗原是臨床E.coli最主要的血清型抗原，我國雞E.coli主要流行的血清型為O1、O2、O12、O78、O142，由于不同血清型之間的菌株缺乏交叉免疫，且每個地區流行的優勢血清型有所不同，從而無法通過疫苗的免疫獲得保護性，給疫苗的研制帶來一定的困難[6-7]。E.coli的致病性不僅與動物種屬有關，還與自身攜帶的毒力有關，致病性E.coli基因組可編碼黏附素、攝鐵系統、溶血素、血清抗性蛋白等多種毒力因子[8]，這些毒力因子在獲取編碼毒力因子的基因后，相互協作，造成機體各器官的損害[9]，是引起機體發病的罪魁禍首。毒力因子與血清型對于E.coli的致病能力起主導作用。

本研究對2019—2020年從河北部分地區分離的181株致病性E.coli進行血清型、毒力基因的檢測，并分析流行特點，為該地區E.coli病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2019-2020年從河北秦皇島、唐山、石家莊、滄州、邢臺等地區的養殖場采集的 225 例疑似E.coli病的病死雞，其中2019年135份樣品，2020年90份樣品。無菌采集疑似E.coli病的病死雞的肝臟、肺臟等組織。E.coli質控菌株ATCC 25922由河北省預防獸醫學重點實驗室保存。

1.2 實驗動物1日齡健康的海蘭褐公雛120只購于河北振志家禽育種有限公司。

1.3 主要試劑普通營養瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂(EMB)均購自北京奧博星生物技術有限責任公司，DL2000 DNA Marker，2×Taq Marker Mix 購自北京康為世紀生物科技有限公司，E.coli血清型鑒定用O型血清因子購自天津生物芯片技術有限公司，ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條購自生物梅里埃中國有限公司。

1.4 細菌的分離培養與鑒定將病死雞的肝臟組織無菌劃線接種于麥康凱平板上，37℃倒置培養12～18 h,挑取麥康凱平板上粉紅色、光滑的單菌落接種于伊紅美藍平板上，37℃培養12 h，挑取伊紅美藍平板上呈黑色、圓形、帶金屬光澤的單菌落在普通瓊脂平板上進行純化培養2～3次，-20℃保存備用。按生化鑒定試劑條說明書進行生化鑒定。

1.5 菌株的PCR鑒定水煮法進行細菌DNA的提取，參照文獻設計16S rRNA的通用引物，引物序列由北京生工合成，上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反應條件為：94℃ 5 min,94℃ 45 s,56℃ 30 s,72℃ 1 min,72℃ 5 min，反應體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL ，無RNA酶水6 μL。將陽性產物進行測序。

1.6 菌株的血清型檢測參照文獻[10]的方法，采用O型血清因子進行玻片凝集試驗，對分離的181株致病性E.coli(2019年105株、2020年76株)進行血清型檢測。

1.7 優勢血清型代表株的致病性試驗根據分離菌株的血清型結果，篩選出了優勢血清型O1、O2、O18、O26、O78，挑選優勢血清型代表株各4株，共20株。將分離純化的菌株培養至對數生長期，采用滴板計數法進行菌落計數，將菌液稀釋至終濃度為2×107CFU/mL。將105只7日齡健康雛雞隨機分為21組，每組5只，第1～20組為攻毒組，每只腹腔注射0.20 mL菌液，每株菌接種1組雛雞；第21組為空白對照組，腹腔注射相同劑量的生理鹽水。觀察7 d，記錄雛雞的精神狀態、食欲情況和死亡情況，對死亡的雞進行剖檢，觀察各臟器病理變化，并對其進行分離及鑒定。

1.8 分離菌株毒力基因的檢測水煮法提取細菌DNA，以提取的DNA為模板，根據文獻[11-12]由北京生物工程有限公司合成毒力基因Vat、astA、hlyF、colv、Ler、eaeA、fimC、papC、sfa、tsh、ompT、Iss、iroN、iucD、iutA、iutB、irp2、fyuA、ECs3703、ECs3737等20對引物，采用 PCR方法進行毒力基因的檢測，膠回收分離菌株的PCR擴增產物進行測序，分離菌株的測序結果與GenBank數據庫中參考株的基因序列進行同源性分析。

2 結果

2.1 細菌的分離鑒定通過對分離菌株進行分離純化、染色鏡檢、生化鑒定、16S rRNA鑒定。結果顯示，從采集的225份病料中分離到了181株E.coli，分離率為80.4%，其中2019，2020年分別分離出105，76株E.coli，分離率分別為77.78%，84.45%。革蘭染色在顯微鏡下觀察菌株的形態呈兩端鈍圓、紅色短桿狀，在麥康凱平板上呈磚紅色、光滑、濕潤的單菌落(圖1A)，在伊紅美藍平板上呈黑色、圓形、帶金屬光澤的單菌落(圖1B)，培養基上的菌株特征與E.coli特征相符。181株分離菌株經ID32E腸桿菌科生化鑒定試紙條鑒定分析，評定結果均符合E.coli生化鑒定標準，符合率為99.50%～99.90%。

A.分離菌株在麥康凱平板上形態特征;B.分離菌株在伊紅美藍平板上形態特征

2.2 分離菌株16S rRNA PCR鑒定181株分離菌株經PCR擴增后，在約1 492 bp處出現目的條帶，與預期結果相符。分離菌株測序結果與GenBank數據庫中登錄的E.coli的參考株基因序列進行比對，同源性在98.8%～99.9%之間，結果表明181株分離菌株均為E.coli。部分菌株的PCR結果如圖2。

M.DL2000 DNA Marker;1～4.臨床分離部分菌株的PCR擴增結果;5.陰性對照

2.3 分離菌株血清型檢測結果用E.coli標準O型血清因子進行玻片凝集試驗檢測分離菌株的血清型，結果顯示 181株致病性E.coli共有18種不同的血清型，以O78、O1、O2、O18和O26為主要流行的血清型，分別占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50% 和10.50%。其中2019年105株致病性E.coli，94株定型，11株未定型，以O26、O1、O18、O78和O2血清型為主，檢出率分別為18.10%，14.29%，12.38%，9.52%和7.62%；2020年76株致病性E.coli，71株定型，5株未定型，以O78、O2、O1、O6和O18血清型為主，檢出率分別為22.37%，17.11%，14.47%，7.89%和7.89%(表1)。

表1 雞源致病性E.coli血清型檢測結果

2.4 致病性試驗結果攻毒組的雛雞發病率為100.00%，總病死率高達82.00%，部分雞在攻毒后6 h開始出現打蔫、精神不佳、食欲下降，死亡7只，攻毒后12～24 h，雞開始拉黃白色稀糞、羽毛粗糙不光滑，死亡42只，攻毒后36～48 h，死亡21只，72 h后，共計死亡82只，總病死率為82.00%，少數攻毒未死亡的雞也有明顯E.coli的發病癥狀。對病死雞進行解剖，發現肝臟腫大無彈性、氣囊渾濁，心臟包膜增厚。無菌采集病死雞的肝臟、肺臟等組織，在鑒別培養基上進行分離鑒定，結果顯示，分離出的菌是E.coli。對照組的雞采食、飲水、排泄均正常，無死亡。

2.5 分離菌株毒力基因檢測通過PCR方法檢測20種毒力基因的攜帶情況，結果顯示，181株致病性E.coli攜帶16種不同毒力基因，未檢測到Ler、eaeA、papC、sfa4種毒力基因(圖3)。

2019年105株致病性E.coli中iutA毒力基因檢出率最高，為96.19%(101/105)；其次為iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703毒力基因檢出率也較高，分別為93.33%，91.43%，90.48%，87.62%，85.71%和83.81%；Vat、iutB、fyuA、colv、tsh、irp2、iucD、astA和Ecs3737毒力基因檢出率為7.62%～76.19%。2020年76株致病性E.coli中hlyF毒力基因檢出率最高為100.00%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因檢出率分別為93.42%～98.68%；Vat、iutB毒力基因檢出率較低，分別為2.63%和23.68%(表2)。

M.DL2000 DNA Marker;1～16.Vat,hlyF,fimC,ompT,Iss,iroN,iucD,iutA,iutB,irp2,fyuA,tsh,colv,astA,Ecs3703,Ecs3737;17.空白對照

表2 2019-2020年雞源致病性E.coli毒力基因檢測結果

多重毒力基因檢測結果顯示，181株致病性E.coli均攜帶多種毒力基因，其中2019年的105株E.coli同時攜帶2～15種毒力基因，其中攜帶2,3和5種基因的菌株各有1株(0.95%)；攜帶11種基因的菌株數最多，高達20株(19.05%)；2020年的76株E.coli同時攜帶4～15種毒力基因，其中攜帶4，7，8和15種毒力基因的菌株最少，均為1株(1.32%)；攜帶13種毒力基因的菌株數最多，高達16株(21.05%)(圖4)。

圖4 2019-2020年致病性E.coli多重毒力基因攜帶情況

2019年的105株E.coli主要攜帶5種毒力譜，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs3703+ECs3737+astA毒力譜檢出率最高，為9.52%，其次是hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜檢出率為7.62%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+ECs370+ECs3737+astA+iutB和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737毒力譜的檢出率均是4.76%。2020年的76株E.coli主要攜帶4種毒力譜，其中hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜檢出率最高，為9.21%，而hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA和hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+ECs370+ECs3737+astA+iutB毒力譜的檢出率均是5.26%，hlyF+fimC+ompT+Iss+iroN+iucD+iutA+colv+tsh+irp2+fyuA+ECs370+ECs3737+astA毒力譜連續2年的檢出率均最高，是2019—2020年最流行的毒力譜(表3)。

表3 不同年份E.coli的主要毒力譜分布

3 討論

3.1 河北部分地區雞源致病性E.coli的血清型分析E.coli血清型種類有百余種，不同地區所流行的血清型有所差異，其所導致的致病能力也各不相同。申子平等[13]對貴陽、遵義地區分離的39株E.coli進行血清型鑒定，結果顯示39株E.coli有8株未定型，其余的31株以O78、O15和O45為優勢血清型，分別占比29.03%，12.90%和12.90%。李蘊玉等[14]對秦皇島地區20株E.coli進行血清型鑒定，結果顯示20株E.coli分屬于O1、O2、O78、O18和O89血清型,分別占比40.00%，30.00%，15.00%，10.00%和5.00%。本研究通過對河北地區的181株致病性E.coli進行血清型鑒定，發現165株E.coli定型，16株未定型，以O78、O1、O2、O18和O26為主要流行的血清型，分別占比14.92%，14.36%，11.60%，10.50%和10.50% 。由此表明致病性E.coli的優勢血清型與所在區域存在很大的聯系。

3.2 河北部分地區雞源致病性E.coli的毒力基因分析禽致病性E.coli不僅含有多個毒力因子，并且不同的毒力因子在E.coli中的流行有較大的差異，致病性E.coli侵入機體后，由于不同的毒力因子相互組合，共同作用而導致發病。劉璨穎等[15]對廣東佛山地區的108株禽致病性E.coli進行9種毒力基因的檢測，結果表明分離菌株的iucD毒力基因檢出率最高，為74.07%(80/108)，其次Iss、tsh和hlyF毒力基因的檢出率為55.56%～62.96%，而papC和vat毒力基因檢出率較低，分別為5.56%和2.78%。盧琴等[16]報道的湖北部分地區的33株禽E.coli的fimH毒力基因檢出率最高，為87.88%，iroD、iucD和estA的檢出率為36.37%～57.58%，而ibeA基因檢出率為0%。本研究結果表明2019年的iutA、iroN、hlyF、ompT、Iss、fimC和Ecs3703的檢出率較高，為83.81%～96.19%，Vat、iutB的檢出率分別為7.62%和34.29%；2020年的hlyF毒力基因檢出率最高為100%；iucD、Iss、ompT和fimC毒力基因檢出率分別為93.42%～98.68%；Vat和iutB毒力基因檢出率較低，分別為2.63%和23.68%，而Ler、eaeA、papC和sfa未檢出。王俊麗等[17]對聊城地區的212株E.coli進行18種毒力基因的檢測，發現分離菌株均攜帶多重毒力基因，155株分離菌攜帶5～9種毒力基因，比例為73.11%。楊娟等[18]對昆明地區的140株雞源E.coli進行12種毒力基因的檢測，發現140株E.coli均攜帶多種毒力基因，同時攜帶5種毒力基因的菌株有7株，比例為5%，攜帶8～11種毒力基因的菌株有102株，比例為72.86%。本研究結果表明分離菌株均攜帶多種毒力基因，2019年的105株E.coli攜帶11種基因的菌株數最多，高達20株(19.05%)，2020年的76株E.coli攜帶13種毒力基因的菌株數最多，高達16株(21.05%)。以上結果表明不同地區E.coli所攜帶的毒力基因種類和數量差異較大，不同地區的E.coli均攜帶多重毒力基因。本研究對該地區雞源致病性E.coli的血清型和毒力基因的流行趨勢進行研究，為研制該病的疫苗提供了數據支持，為防治雞源E.coli病提供了理論依據。