不同年齡成年伊犁馬糞便真菌群落結構的分析

陳雪靜,吾爾恩·阿合別爾迪,木古麗·木哈西,瑪依拉·吐爾地別克

(伊犁師范大學 生物與地理科學學院,新疆 伊寧 835000)

新疆維吾爾自治區是我國馬品種數量最多的省份。馬產業是新疆地方特色且重要的現代畜牧業，它對改善新疆農村經濟狀況、增加牧民收入、促進社會和諧具有極為重要的意義。新疆的馬肉產量對我國乃至世界馬肉產量均具有重大貢獻。截止到2017年末我國馬匹存欄為343.7萬只，其中新疆占比為20.0%，全國排名第二，僅次于四川省，是我國主要馬匹養殖區之一。伊犁州直屬縣(市)、阿勒泰和塔城地區擁有全疆大部分馬產業，馬匹存欄量分別占全疆總量的45.1%、14.8%和12.1%，馬肉產量分別達到33 811 t、4 520 t和10 242 t，占全疆馬肉總產量的73%。這三個地區主要品種為伊犁馬和哈薩克馬。

近年來腸道菌群成為學術界熱點研究領域之一。人體是由數以萬億計的細胞組成，而胃腸道中聚集的微生物的數量也達到了同樣的數量級，在其他動物腸道內微生物數量和種類也非常豐富，因此腸道菌群的微生態平衡就像一種器官，對機體各種生理功能具有非常重要的作用。動物胃腸道菌群可以直接影響機體的能量代謝、消化功能、黏膜免疫系統的發育、疾病的發生和發展，對于馬等草食動物而言更是如此，其生活主要依賴于胃腸道內的微生物對纖維素等結構性碳水化合物的發酵作用。

國內外對馬腸道微生物，尤其對腸道真菌群落結構和多樣性的研究較罕見。邢振存采用PCR-DGGE技術從蒙古馬和純種馬糞便分別檢測到31個真菌，分別屬子囊菌門、擔子菌門和新麗鞭毛菌門，子囊菌門含量最多。楊頊等構建我國西藏自治區天然放牧馬糞樣的ITS克隆文庫，檢測到子囊菌門的Pezizales、Thelebolales、Pleosporales三個目，以及另一個盤菌綱內未確定目(Uncultured in Pezizomycetes)。Mura等通過ITS克隆文庫的構建，從盎格魯-阿拉伯馬腸道樣品中共檢測到厭氧真菌的3個屬，即、、，均隸屬于Neocallimastigaceae(新美鞭菌科)，具有完整、有效的纖維素降解酶系。然而，以上DGGE、克隆文庫等傳統分子生物學技術具有不能完整地反映整個群落的結構信息等局限性。與之相比，高通量測序技術對微生物群落信息的采集與分析更準確、詳細。

昭蘇馬場位于素有“天馬故鄉”美稱的伊犁州昭蘇縣境內，是我國重要馬產業基地，主要承擔伊犁馬選育的核心任務。新疆一些少數民族自古便有食用馬肉的生活習慣，通常選擇4～12歲伊犁馬進行屠宰，然而從營養成分和人體攝入能量的角度，以及屠宰性狀指標和器官重量等肉用性能的角度考慮，加之飼養管理成本的因素，5～6歲為適宜屠宰年齡階段。另外，5～8歲年齡階段的伊犁馬競賽技能最好。

本研究采用高通量測序技術研究以上4個年齡階段伊犁馬糞便真菌群落的組成，探討伴隨年齡增長伊犁馬腸道菌群的動態變化情況，糞便是了解腸道微生物群落的重要樣品，微生物占糞便的30%以上，并且新鮮糞便中絕大多數微生物是活菌，對揭示伊犁馬腸道微生物的生物多樣性和馬腸道疾病的診斷具有重要的理論指導作用，對飼用益生菌或生物性添加劑的開發提供理論數據，對我區馬產業的發展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗動物為新疆伊犁昭蘇馬場 (80°51′～81°03′E，42°25′～43°15′N) 自由放牧的4歲、6歲、8歲和12歲四個不同年齡分組的雄性伊犁馬匹，每組3匹，共12匹。馬腸道樣品為7月份采集的新鮮糞便，分別標記為ZS.4、ZS.6、ZS.8和ZS.12。

1.2 腸道微生物基因組DNA的提取

采用美國強力土壤DNA提取試劑盒(MOBIO Power Soil DNA Isolation Kit)分離糞便樣本全基因組，按照說明書上步驟進行。將提取得到的糞便基因組加入100μL去離子水溶解，取5μL用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(0.5×TAE緩沖液)，檢測DNA的相對濃度和質量，使用無菌水稀釋DNA樣本至1 ng/μL。

1.3 ITS序列的PCR擴增與測序

以稀釋后的基因組DNA為模板，以ITS5-1737F和ITS2-2043R作ITS1可變區特異引物，通過高效、高保真酶進行PCR擴增。反應體系參照說明書，反應條件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環；72 ℃ 10 min。所得到的擴增PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測合適后進行測序 (測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成)，使用New England Biolabs公司高效和高保真酶PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer進行PCR擴增，確保擴增效率和準確性，采用Illumina NovaSeq6000測序平臺測序。

1.4 數據分析

利用Uparse軟件對Effective Tags進行聚類，對獲得的序列以97%的一致性聚類劃分為OTU(Operational Taxonomic Unit)。OTUs中出現頻率最高的序列選取為OTUs的代表序列，然后用QIIME軟件中的blast方法與Unit(v7.2)數據庫進行物種分析和注釋，并分別在界、門、綱、目、科、屬等分類水平上統計樣本微生物群落組成。以樣本中數據量最少的為標準進行均一化處理，基于均一化處理后的數據進行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

利用QIIME軟件計算樣品包括Chao1指數和Shannon指數的α多樣性值，其中群落豐富度用Chao1指數描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高。Shannon指數可以反映樣品物種的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高。

2 結果與分析

2.1 測序結果質量分析

通過對樣品測序得到原始序列條數為344 827，過濾掉低質量的序列后，共獲得有效序列總數為309 227。根據barcode標簽進行樣品序列拆分，再對初始序列進行去冗余處理后，獲得16S rDNA Unique Reads，并將其聚類為用于物種分類的OTU，統計得到各個樣品在不同OTU中的豐度信息，四組樣品共產生89～132個OTU，有效序列比例均大于74%以上，各樣品的相關數據如表1所示。

稀釋曲線能夠可直接反映出測序數據量的合理性，并間接反映樣本中物種的豐富程度，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量漸進合理，更多數據量只會產生少量新物種(OTUs)從稀釋曲線(圖1)中可知，序列數量到75 000時各樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣基本合理，真實環境中細菌群落結構的置信度較高，能夠比較真實地反映樣本微生物群落。

2.2 各樣品中真菌多樣性及相關性分析

如表2所示，四組樣品的4個指數，即Chao1、Ace、Shannon和Simpson指數的大小依次為ZS.6>ZS.4>ZS.8>ZS.12，說明物種多樣性和豐富度在ZS.6最高，而在ZS.12中最低。Shannon和Simpson指數4個年齡組間統計差異較顯著(<0.05)，而Chao1和Ace指數統計差異不顯著(>0.05)。

表1 樣品測序數據統計Table 1 Sequencing data statistics

圖1 相似度為0.97條件下各樣品組的稀釋曲線Fig. 1 Rarefaction curves of each group at cut-off level of 3%

在0.97的相似度下，得到了每個樣品的OTU個數，利用R軟件繪出韋恩圖，分析不同樣本組之間共有、特有的OTU數目，直觀展示樣品間OTU的重疊情況。結合OTU所代表的物種，可以找出不同環境中的核心微生物。如圖2所示，4組共有的OTU數量為43。每組特有的OTU數量占總OTU數量的比例依次為ZS.4(35.8%)>ZS.6(22.7%)>ZS.8(19.1%)>ZS.12(5.6%)，說明隨著年齡的增加腸道微生物特有微生物的數量逐漸減少。

表2 各組真菌多樣性指數Table 2 Diversity indices of fungi in each group

2.3 腸道菌群組成分析

比較不同年齡伊犁馬腸道優勢菌門、科、屬的相對豐度可知，隨著成年伊犁馬的年齡增長，其優勢菌的相對豐度均發生變化。

本試驗中共檢測到4個真菌門分類物種，分別為Ascomycota (子囊菌門)、Basidiomycota (擔子菌門)、Neocallimastigomycota (新美鞭菌門)、Mucoromycota (廣古菌門)，所占比例如圖3。

ZS.4中相對豐度大小依次為Ascomycota> Basidiomycota> Neocallimastigomycota >Mucoromycot，Ascomycota的OTU數量占的比例最高，占30.1%，該門類在4歲馬腸道中相對豐度在四組樣品中最高，并隨著年齡的增加逐漸減少。在ZS.6、ZS.8和ZS.12作為最優勢門類的Basidiomycota在該三組隨年齡增加而逐漸減少。Neocallimastigomycota在4歲馬腸道中的豐度較高，為8.3%，而其余3個年齡伊犁馬腸道中均較低。未知菌類隨著年齡的增加顯著增高。

圖2 四個樣品組中真菌多樣性的相關性分析Fig. 2 The similarity analysis of fungaldiversity among four groups

在科的水平上，總共47個類群被分類，其中最優勢菌為Cryptococcaceae和Pichiaceae，其次是Neocallimastigaceae、Sporormiaceae、Aspergillaceae、Lasiosphaeriaceae、Didymosphaeriaceae等。Pichiaceae在4歲馬腸道中最高，隨年齡增加逐漸減少，在12歲馬腸道中極少。Cryptococcaceae 科的相對豐度為ZS.6>ZS.4>ZS.8>ZS.12，從6歲開始逐漸減少。Neocallimastigaceae在4歲伊犁馬腸道中明顯高于其他三組。未知菌類隨著年齡的增加呈顯著增高趨勢，如圖4。

圖3 不同年齡成年伊犁馬門水平上腸道微生物相對豐度Fig. 3 Relative abundances of fungi in intestineof different age groups at phylum level

圖4 不同年齡成年伊犁馬科水平上腸道微生物相對豐度Fig. 4 Relative abundance of fungi in intestine ofdifferent age groups at family level

在屬的水平上共檢測到56個被分類的真菌，其中優勢菌為和，的比例隨年齡的增加而明顯減少，隨著年齡增加呈逐漸減少。在ZS.4中豐度較高。未知菌類占的比例隨年齡增加逐漸提高，在ZS.12中達到83.6%，如圖5。

圖5 不同年齡成年伊犁馬屬水平上腸道微生物相對豐度Fig. 5 Relative abundance of fungi in intestine ofdifferent age groups at genus level

3 討 論

腸道菌群寄居在機體腸道中，是由細菌、真菌、古生菌、原生動物等相互協同、相互制約構成的，龐大而又復雜的微生物體系，數量驚人，種類非常多，不同的微生物群體發揮著不同的功能，直接參與宿主的食物消化、營養吸收、能量代謝、免疫應答等諸多機體的生理功能。腸道菌群可以通過代謝活動維持動物腸道的健康以及動態平衡。與細菌相比，腸道內的真菌數量和種類較少，但對腸道動態平衡的維持也同樣起重要作用。腸道內的真菌與細菌之間具有密切關系，通過互利共生、拮抗等關系，支持和保護彼此的生長發育。腸道菌群群落結構可受到來自宿主方面的很多因素的影響，如不同類型食物的攝入、年齡的增長、抗生素的使用情況以及宿主的健康狀況等，另外也受到生活地域、季節和飼養條件等很多環境因子的影響，其中宿主的年齡的差異明顯影響腸道菌群結構。本研究采用ITS1測序方法對伊犁馬腸道菌群群落結構進行分析，初步揭示伊犁馬腸道真菌菌群結構，為更深入了解伊犁馬腸道微生物結構，以及預防和檢測疾病奠定基礎。

本試驗四組樣品Shannon和Chao1指數的數據顯示真菌群落物種多樣性和物種豐度隨年齡先有增加，后有減少的趨勢。對同樣四組樣品中真菌Shannon和Chao1指數的分析顯示，真菌群落物種多樣性隨年齡增加而減少，而細菌物種豐富與年齡無相關性(數據未發布)。綜合以上結果可知，導致真菌多樣性和群落豐度的這種變化趨勢的主要因素是馬年齡，而不是細菌群落變化。

本研究發現伊犁馬腸道真菌的優勢菌為Ascomycota、Basidiomycota、Neocallimastigomycota、Mucoromycota。研究表明Ascomycota、Basidiomycota在家牛、綿陽、山羊、家兔等草食動物糞便中均為優勢菌。另外，華彥等通過高通量測序證明華北豹腸道中真菌以Ascomycota數量最多，其次為Basidiomycota和Mucoromycota。艾生權等采用RFLP法分析結果顯示亞成體大熊貓腸道真菌主要為Ascomycota、Basidiomycota 2個門。Mura等通過試驗證明盎格魯-阿拉伯馬腸道厭氧真菌中Neocallimastigomycota最數量多。這些研究結果表明，在以上的幾種動物類群間，其腸道真菌菌群結構在門水平上有相似之處。

本研究發現在屬的水平上，伊犁馬腸道中的優勢菌為(隱球酵母菌屬)和(畢赤酵母屬)。4歲馬腸道中Pichia相對豐度最高，其次是，而6歲、8歲和12歲馬腸道中相對豐度最高，其次為Pichia。

圓形或橢圓形、胞外具有莢膜結構的一種真菌，該屬已被分類的種有37個，其中除了、和等少數幾種之外，其他成員對人類沒有致病性。本試驗數據中隱球酵母菌相關序列均屬于未知菌類，未發現以上幾種真菌相關DNA序列。多數可將甲醇作為唯一碳源和能源生長繁殖，可能對降低腸道中甲醇含量具有一定作用。有報道表明酵母菌含有維生素、酶等物質，對動物腸道的微生物平衡具有很強的恢復能力，可以提高動物的生產性能，現階段被廣泛應用于飼料工業上。本研究發現隨成年伊犁馬年齡的增長，以上兩種酵母菌的相對豐度下降，這也從真菌的角度說明，成年伊犁馬4～6歲為對營養物質的消化能力最強的年齡階段。是一種反芻動物瘤胃中最重要的厭氧真菌，不僅具有降解纖維素，還具有降解蛋白質和淀粉等物質的能力，因此在飼料消化過程中起重要作用。在4歲伊犁馬糞便中的相對豐度較高，該數據同樣支持成年階段中4～6歲伊犁馬消化能力最強。本研究數據中屬于的OTU基本上都是。相關研究表明為反芻動物消化道中較普遍的厭氧菌，對纖維飼料水解作用是通過產生纖維素酶來進行。

4 結 論

比較不同年齡成年伊犁馬腸道優勢菌門、科、屬的相對豐度可知，隨著成年伊犁馬的年齡增長，其優勢菌的相對豐度均發生變化。本研究對新疆地區成年伊犁馬糞便真菌組分進行了分析，揭示了伊犁馬腸道菌群的多樣性，為更深入地了解伊犁馬真菌群落結構奠定了一定的基礎。