小檗堿對不同茶樹炭疽菌的抑菌活性及作用機制

張志鵬，程慶華，謝靖康，萬宇鶴，童華榮，陳應娟

小檗堿對不同茶樹炭疽菌的抑菌活性及作用機制

張志鵬，程慶華，謝靖康，萬宇鶴，童華榮，陳應娟*

西南大學食品科學學院茶學系/食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400715

為研究小檗堿在茶炭疽菌（）引起的茶樹葉部病害防治中的應用前景，以松針炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重慶炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和膠孢炭疽菌（）5種不同茶炭疽菌為研究對象，研究了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌活性，并比較了其抑菌活性差異。研究結果表明，小檗堿對和的抑制效果最好，在質量濃度為12?mg·mL-1時達到100%抑菌率，其次是、和，其抑菌中濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1。顯微鏡鏡檢發現，小檗堿對5種炭疽菌的菌絲和分生孢子均存在明顯影響，隨小檗堿濃度的增加，部分菌絲出現不規則膨大現象，分生孢子形態也出現扭曲變形；生物活性檢測發現，小檗堿處理后，不同炭疽菌的細胞結構均出現不同程度損傷，細胞膜的通透性增大、細胞氧化應激反應增強。研究結果明確了小檗堿對茶樹炭疽菌的抑菌活性及應用前景，為炭疽菌引起的茶樹病害的防治提供了新的途徑及理論依據。

小檗堿；茶炭疽菌；抑菌活性；作用機制

茶樹病害的防治一直是茶學研究的重要方向，是茶葉安全生產的重要內容。由炭疽菌（）引起的茶云紋葉枯?。˙rown blight disease）是茶園中的常見病害，在世界各茶葉種植區均有不同程度的發生。炭疽菌主要為害茶樹葉部，一般從茶樹葉片背部的毛孔侵入，經8～15?d潛伏期后開始形成病斑，在溫暖濕潤的條件下易造成該病大面積的暴發流行，導致茶葉產量和品質下降，造成嚴重的經濟損失，嚴重阻礙茶產業的發展[1-3]。目前，炭疽菌引起的茶樹病害防治仍以化學農藥為主，農藥的不當或過量使用不僅會出現茶葉農殘超標等問題，還會加速茶園生態環境的惡化，造成巨大的經濟損失和資源浪費。因此，篩選高效、低毒、低殘留的防治方法是茶產業發展的必然趨勢。

小檗堿（Berberine）又名黃連素，屬異喹啉類生物堿，分子式為C20H18NO4，是植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，也是黃連、黃柏、功勞木、三顆針等中藥材中的主要有效成分[4-5]。最新研究表明，小檗堿具有良好的抗細菌、抗真菌、抗炎和抗癌等功效，在農業上兼具殺蟲、殺菌和除草等活性[6-10]。目前，小檗堿憑借其殺菌活性在植物上被廣泛應用，但未見在茶樹上應用的相關報道。本研究以5種不同茶樹炭疽菌種為研究對象，研究小檗堿對不同茶炭疽菌的抑菌活性，進一步通過顯微鏡鏡檢分析、生物活性檢測等研究小檗堿對茶樹炭疽菌的作用機制，以明確小檗堿在炭疽菌引起的茶樹病害防治中的應用前景，以期為茶樹炭疽菌的病害防治提供新的途徑，為茶園安全生產做貢獻。

1 材料與方法

1.1 供試培養基與小檗堿母液

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato dextrose agar，PDA）配制：將馬鈴薯去皮洗凈后，取200?g切成小塊，加1?L水煮至馬鈴薯可以輕易被戳碎，用8層紗布過濾之后，將濾液倒回洗凈的鍋中小火加熱，加入20?g葡萄糖和20?g瓊脂，攪拌至溶解，將濾液定容至1?L，分裝，高壓滅菌后備用。

馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（Potato dextrose broth，PDB）為不加瓊脂的PDA液體培養基。

小檗堿母液配制：精準稱取小檗堿粉末10?g置于100?mL的燒杯中，加入適量的二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解，再用ddH2O配制成質量濃度為600.0?mg·mL-1的母液，轉移至50?mL容量瓶中，用ddH2O將燒杯洗滌2～3次后定容到刻度線處，過濾除菌后待用。

1.2 菌株

本研究所采用茶炭疽菌種是2016年至2019年在重慶市茶葉種植區采集的茶樹感病樣本，經形態學和多基因遺傳進化分析鑒定為松針炭疽菌（）、喀斯特炭疽菌（）、重慶炭疽菌（）、山茶炭疽菌（）和膠孢炭疽菌（）[1,11-12]。

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌活性測定

取保存備用的滅菌PDA，用微波爐加熱至PDA全部融化，待冷卻至50℃時，取一定量的小檗堿母液在超凈臺上加入到PDA中，分別配制成1.0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0?mg·mL-1的濃度梯度，將培養5?d的菌種打取菌餅接種至不同濃度的含藥培養基中，(26±2)℃培養5～7?d，觀察菌落生長情況，在6?d時用相機拍攝菌落狀態，每次試驗設置兩個平行，試驗重復3次，通過SPSS 20.0計算抑菌中濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）和顯著性分析，Adobe Photoshop CS5處理菌絲圖片。

菌落生長抑制率計算公式：

式中，C為對照菌落直徑，T為處理菌落直徑。

1.3.2 菌絲和分生孢子的培養及形態觀察

取滅菌過的PDA，將PDA分別配制成含EC50和質量濃度為10?mg·mL-1的小檗堿培養基，以空白PDA為陰性對照（CK），用打孔器（d=7?mm）取在PDA上培養5?d的炭疽菌餅分別接種于CK、含EC50和10?mg·mL-1濃度小檗堿的培養基上，(26±2)℃培養箱中培養5～10?d，在顯微鏡下觀察菌絲和分生孢子生長形態特征。

1.3.3 相對電導率的測量

將PDA上培養5?d的炭疽菌菌落用打孔器（d=7?mm）各取兩塊菌塊，接入含不同濃度小檗堿的PDB中，在26℃，160?r·min-1條件下振蕩培養72?h，用電導率儀測量培養液的相對電導率（Relative conductivity），然后將培養液加熱至沸騰，待冷卻后再測1次電導率。試驗重復兩次，每次3個重復。

相對電導率計算公式：

1.3.4 丙二醛（MDA）含量的測定

將PDA上培養5?d的炭疽菌菌落打取菌餅接種于PDB培養液中，在26℃，160?r·min-1條件下培養48?h后，加入小檗堿使其終質量濃度為12.0?mg·mL-1，以不加藥劑的PDB為對照。分別在藥劑加入后0、12、24?h從培養液中取待測液。

取0.5?mL待測液，加入0.5?mL硫代巴比妥酸（0.67%，/），混合加熱30?min，待其冷卻后，低速離心10?min后測定吸光度，測定前用5%三氯乙酸溶液調零，分別在450、532?nm和600?nm處測定吸光值并計算MDA含量，μmol·mL-1。

MDA含量=[6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450]×提取液

1.4 數據分析

試驗數據利用Excel 2016進行初步整理分析，通過SPSS 20.0軟件進行抑菌率分析、單因素方差分析，并建立毒力回歸方程，計算相關系數和EC50，利用Tukey進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 小檗堿對5種炭疽菌的抑菌活性比較

如圖1所示，小檗堿對5種炭疽菌均具有較好的抑菌活性，但對不同炭疽菌種表現出明顯的差異性，抑菌效果由高到低依次為、、、和，其EC50分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1（表1），表明和對小檗堿更為敏感。在小檗堿質量濃度為12.0?mg·mL-1時，和的菌落生長完全被抑制，達到100%的抑菌效果，而對和的抑菌效果分別為85.51%、84.31%、89.58%；小檗堿質量在15?mg·mL-1時對和的抑菌活性也達到100%。

2.2 小檗堿對炭疽菌菌落生長情況的影響

如圖2所示，在PDA上正常培養7?d時，菌落正面整體呈白色，反面顏色呈淺黃色；菌落表面菌絲呈灰白色，菌落中心呈現明顯的橙紅色；正面整體為白色，反面為淡黃白色，菌絲生長均勻；菌落表面菌絲呈灰白色，背面為淡橙紅色，尤其是在菌落中央顏色較深，菌絲整體生長均勻；菌落白色，菌絲生長茂密且均勻。不同質量濃度的小檗堿（1～12?mg·mL-1）處理后，培養基由于藥劑的加入呈現由淺黃色到深黃色的顏色變化，5種炭疽菌的菌落生長均受到了明顯的抑制，但菌落形態變化不大。隨小檗堿質量濃度增大，在12?mg·mL-1時，5種炭疽菌的菌絲呈現簇狀生長狀態，生長發育受到顯著抑制。

圖1 不同濃度小檗堿對5種炭疽菌的生長抑制率

表1 小檗堿對5種炭疽菌的毒力分析

圖2 5種炭疽菌在不同濃度小檗堿作用下的菌落生長情況

2.3 小檗堿對不同炭疽菌菌絲生長的影響

如圖3所示，正常生長情況下，5種炭疽菌的菌絲整體生長均勻，但隨小檗堿濃度的升高，不同炭疽菌種的菌絲數量急劇減少，生長形態也發生了明顯的變化。EC50濃度處理下，和的部分菌絲形態呈現不均勻增粗或局部不規則膨大現象，而其他3種炭疽菌的菌絲形態在低濃度小檗堿作用下變化不大。隨著小檗堿濃度的增大，和的菌絲生長不正常狀態加劇，呈現較多短小分枝生長明顯受到抑制，和其他2種炭疽菌的菌絲生長也受到不同程度的影響，但程度明顯低于和。

2.4 小檗堿對炭疽菌分生孢子的影響

如圖4所示，正常生長狀態下，和的分生孢子均呈圓柱狀，末端呈鈍形或微向底部狹窄，整體透明，內部無隔膜，大?。ㄩL×寬）分別為(11.7～18.9)μm×(4.1～7.61)μm、(12.60～18.50)μm×(4.30～7.50)μm和(14.1～18.4)μm×(6.8～8.6)μm；的分生孢子呈紡錘形，透明，無隔膜，大小為(10.9～17.3)μm×(3.5～5.8)μm；分生孢子呈圓柱形，兩端鈍或向基部狹窄透明，無隔膜，大小為(11.1～15.3)μm×(5.1～7.4)μm[1,11-12]。在小檗堿EC50濃度處理下，5種炭疽菌的部分分生孢子生長受到一定程度的抑制，但表現不明顯，隨著小檗堿濃度的升高，分生孢子數量大幅度減少，在10?mg·mL-1時，未觀察到分生孢子的生長，而其他4種炭疽菌的部分分生孢子形態發生了顯著變化，主要表現為分生孢子兩端不對稱生長、整體伸長或縮短、局部不規則膨大等，表明高濃度小檗堿能明顯抑制分生孢子的生長。

圖3 小檗堿對茶炭疽菌菌絲生長的影響（標尺=10?μm）

圖4 小檗堿對茶炭疽菌分生孢子生長的影響（標尺=10?μm）

2.5 小檗堿對茶炭疽菌細胞膜通透性的影響

細胞相對電導率的大小可以作為衡量細胞膜透性的指標之一[13]。試驗結果顯示，在正常振蕩培養72?h后，5種炭疽菌的相對電導率較高，在88.94%～92.33%，這可能是菌落培養時間較短造成的差異，但不同菌種之間其相對電導率存在一定的差異。不同濃度的小檗堿處理后，5種炭疽菌的相對電導率整體呈增高趨勢，但在小檗堿濃度較低時，即1?mg·mL-1時，和的相對電導率與對照（處理0?h）相比有不同程度的降低，這可能是由于低濃度藥劑對炭疽菌的抑菌活性較小，對不同炭疽菌細胞膜通透性的作用表現出一定程度的不穩定性和差異；之后隨小檗堿濃度的升高表現為增高趨勢，表明在小檗堿的作用下，5種炭疽菌的細胞膜均出現不同程度損傷，且隨小檗堿濃度的增大損傷程度加?。▓D5）。

2.6 小檗堿對茶炭疽菌細胞抗氧化能力的影響

MDA是細胞在逆境脅迫下脂質過氧化作用的主要產物之一，MDA的含量是衡量細胞脂質過氧化程度的重要指標之一[14]。如圖6所示，處理0?h時，5種炭疽菌的MDA含量無顯著變化；在小檗堿處理12?h時，5種炭疽菌的MDA含量均急劇升高，表明在小檗堿處理下，炭疽菌的細胞氧化應激反應急劇加強，細胞脂質過氧化的程度加??；在處理12～24?h內，5種炭疽菌的MDA含量又呈急劇下降的趨勢，表明在處理12?h后，炭疽菌細胞開始出現大量死亡，氧化應激反應減弱，MDA含量下降。整體來說，5種炭疽菌的MDA含量存在相似的變化規律，但不同炭疽菌的變化幅度存在一定的差異性。

3 討論與結論

由炭疽菌引起的茶云紋葉枯病是茶樹的主要葉部病害之一[1-2]，目前，茶樹病蟲害防治還是以化學防治為主，但農藥殘留和病原抗藥性等問題突出，而植物源藥劑開發是解決這個問題的綠色、安全、有效的途徑之一。小檗堿，是一種異喹啉類生物堿，以其顯著的廣譜抗菌性，被廣泛應用于臨床疾病的治療方面，據報道，小檗堿能有效抑制金黃色葡萄球菌、腸球菌和鏈球菌，包括多重耐藥性的結核桿菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[7-9]。目前，小檗堿作為植物殺菌劑，被證實對桃褐腐病菌、蘋果輪紋病菌和番茄早疫病菌具有顯著的抑菌效果[5,7,15]，可見，小檗堿具有開發成農用化學抑菌劑的潛力，而小檗堿在茶樹病蟲害防治領域的研究卻未見有報道，防治效果尚不明確。本研究以5種不同茶樹炭疽菌為研究對象，證實了小檗堿對5種炭疽菌均具有較好的抑菌活性，但對不同炭疽菌種表現出明顯的差異性，明確了小檗堿在茶炭疽菌引起的茶樹病害防治中的應用前景。

圖5 不同濃度小檗堿對茶炭疽菌相對電導率的影響

圖6 小檗堿處理后茶炭疽菌MDA含量的變化

研究證實，小檗堿會抑制麥角甾醇的合成，使細胞膜通透性增大，從而造成細胞內物質如核酸、蛋白質的泄露，小檗堿也會造成菌體細胞膜膜電位去極化和脂質過氧化。小檗堿防治引起的番茄早疫病的顯微鏡鏡檢發現，小檗堿處理后的菌絲形態發生了明顯變化，菌絲表面變得褶皺、凹陷，并且隨小檗堿濃度的增大，病原菌出現質壁分離現象[5,7]，因此，推測小檗堿通過抑制細胞膜來發揮抑菌功效。小檗堿處理后病原菌相對電導率明顯增加，說明小檗堿造成了菌體細胞的滲漏和胞內物質外流[5,7]。這些研究結果與本研究中小檗堿對茶樹炭疽菌的作用機制較為一致，小檗堿對5種不同炭疽菌的菌絲和分生孢子生長均存在一定程度的影響，隨小檗堿濃度的增大，炭疽菌菌絲出現不規則膨大現象，部分分生孢子形態也出現扭曲變形，菌體的細胞結構出現不同程度損傷，細胞膜的通透性增大，細胞氧化應激反應增強，這為小檗堿在炭疽菌引起的茶樹病害防治研究提供了理論依據。但在農業生產上，長期單一化學藥劑的使用易使病原菌抗藥性增強，藥劑防治效果降低。藥物復配是兩種或者兩種以上不同作用機制的藥物按照一定的配比聯合使用，利用藥劑之間的協同增效作用，達到減少用量、節約成本、提高防效等效果[16-17]。兩種或多種殺真菌劑的混合使用策略已達數十年，己成功控制多種作物的真菌病害[18-19]，因此，后續開展小檗堿藥劑復配研究將對茶樹病害的長期、高效防治具有重要意義。

本研究以5種不同茶樹炭疽菌為研究對象，證實了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌活性，并發現小檗堿對不同茶樹炭疽菌的抑菌效果存在明顯差異，抑菌效果由高到低依次為、、、、，其EC50分別為2.828、3.288、4.164、4.778、5.104?mg·mL-1，表明和對小檗堿更為敏感。研究結果明確了小檗堿對由炭疽菌引起的茶云紋葉枯病病害防治中的應用前景。顯微鏡鏡檢發現，在小檗堿處理下，炭疽菌的菌絲和分生孢子的生長均受到不同程度的影響，隨小檗堿濃度的增大，部分菌絲和分生孢子形態出現不同程度的變化，菌體的細胞結構也出現不同程度損傷，細胞膜通透性增大，細胞脂質過氧化加劇，從而抑制了病原菌的生長發育，初步明確了小檗堿對不同炭疽菌的抑菌機制，為小檗堿在茶樹病害防治中的應用提供了理論基礎。

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The Antifungal Effect and Mechanism of Berberine on DifferentSpecies Causing Tea Brown Blight Disease

ZHANG Zhipeng, CHENG Qinghua, XIE Jingkang, WAN Yuhe, TONG Huarong, CHEN Yingjuan*

National Demonstration Center for Experimental Food Science and Technology Education, Department of Tea Science, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China

To explore the application prospects of berberine on the prevention and control of tea diseases, the antifungal activity of berberine against five differentspecies (,,,and) were studied and the differences in antifungal activities were compared. The results show that berberine has the best inhibitory effect on bothand, reaching 100% at the concentration of 12?mg·mL-1, followed by,and. The EC50(Concentration for 50% of maximal effect) of the fivespecies were 2.828, 3.288, 4.164, 4.778?mg·mL-1and 5.104?mg·mL-1, respectively. The conidial and hyphal morphology of fivespecies under the treatment of berberine were examined, showing that berberine had a significant impact on the mycelial and conidial growth of fivespecies. With the increase of berberine concentration, part of hyphae expanded irregularly and the conidia grew abnormally. Results of the biological activity ofspecies show that the cell structure was damaged, the permeability of cell membrane was increased and the cell oxidative stress response was enhanced. Results of this study firstly confirm the antifungal activity and application prospects of berberine againstspecies, which provided a new approach and theoretical basis for the prevention and control of tea disease caused by.

berberine,, antifungal activity, mechanism

S571.1；S435.711

A

1000-369X(2022)03-367-09

2021-12-20

2022-03-16

重慶市技術創新與應用發展專項重點項目（cstc2021jscx-tpyzxX0010）、大學生創新創業訓練項目（202110635062和S202110635293）、中央高?；緲I務費重點項目（XDJK2020B046）

張志鵬，男，本科在讀，主要從事茶樹栽培與病蟲防控相關研究，2072312650@qq.com。*通信作者：cyj8@swu.edu.cn

（責任編輯：黃晨）