微生物耦合CdS 光催化降解磺胺甲唑的機理研究

陳泉林，梁競文，曾翠平，劉廣立，張仁鐸，駱海萍

（1.中山大學環境科學與工程學院，廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室，廣東廣州 510006；2.中國科學院深圳先進技術研究院，深圳合成生物學創新研究院，中國科學院定量工程生物學重點實驗室，廣東深圳 518055）

產乙酸混菌中細菌種類豐富，并且存在天然的相互作用，其在代謝過程中的氧化還原反應也使其具備降解污染物的巨大潛能。同型產乙酸菌是一類能夠利用乙酰輔酶A 途徑固定CO2的微生物類群，在Cd2+脅迫下，同型產乙酸菌能夠利用自身代謝過程在溫和條件下形成具有特定形態和結構的CdS 納米顆粒，CdS 在光激發下產生的電子能夠為同型產乙酸菌提供電子供體，在無其他電子供體存在的情況下實現高效產酸和光能向化學能的轉化〔5-6〕，該系統已在能源生產、生物制造等領域展現出巨大的潛力。然而，目前關于SMX 降解的研究多以純菌為主，關于混合菌群-CdS 耦合系統降解SMX 的研究甚少。

微生物耦合半導體光催化系統能夠結合微生物的生物催化性能和半導體材料的光催化降解性能，在含多環芳烴、偶氮染料等廢水的處理中展現出優異的降解性能，但關于這一系統降解藥品和個人護理用品（PPCPs）類污染物的效果及機制研究仍較為欠缺。在產乙酸混菌-CdS 耦合系統中，CdS 具有良好的導電性、較大的比表面積、優異的可見光催化性能以及良好的生物相容性，能夠促進微生物的光電化學過程〔6〕。CdS 在可見光激發下產生的電子和空穴能夠驅動氧化還原反應，將復雜污染物轉化為結構簡單的中間產物，光催化和生物催化的協同作用有望實現SMX 的高效降解。

本研究采用產乙酸混菌構建產乙酸混菌-CdS耦合系統，通過SEM、EDS、XRD 表征證實CdS 在細菌表面成功合成，考察了該系統對SMX 的降解性能和CdS 濃度對降解效果的影響，利用LC-MS 分別探究了SMX 的生物降解路徑、光催化降解路徑以及在微生物耦合光催化系統中的降解路徑。

1 實驗部分

1.1 試劑及儀器

自養培養基A 成分：0.5 g/L NH4Cl、0.1 g/L KCl、0.412 4 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.458 4 g/L K2HPO4·3H2O、0.23 g/L KH2PO4、2.1 g/L 2-溴乙基磺酸鈉、10 mL微量元素溶液〔1.5 g/L氨三乙酸、3 g/L MgSO4·H2O、0.5 g/L MnSO4·H2O、1 g/L NaCl、0.1 g/L FeSO4·7H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.1 g/L CoCl2·6H2O、0.13 g/L ZnCl2、0.01 g/L CuSO4·5H2O、0.01 g/L AlK（SO4）2·12H2O、0.01 g/L H3BO3、0.025 g/L Na2MoO4、0.024 g/L NiCl2·6H2O、0.025 g/L Na2WO4·2H2O〕、10 mL 維生素溶液（2 mg/L 維生素H、5 mg/L 維生素B1、10 mg/L 維生素B6、5 mg/L維生素B2、2 mg/L葉酸、5 mg/L煙酸、5 mg/L泛酸、0.1 mg/L 維生素B12、5 mg/L 對氨基苯甲酸、5 mg/L 維生素B14）。

富集培養基B 成分：0.4 g/L NaCl、0.4 g/L NH4Cl、0.272 2 g/L MgCl2·6H2O、0.05 g/L CaCl2、0.25 g/L KCl、0.8 g/Lβ-甘油磷酸鈉、2.5 g/L NaHCO3、0.5 g/L酵母粉、0.5 g/L 蛋白胨、10 mL 微量元素溶液（成分同上）、10 mL 維生素溶液（成分同上）。

儀器：HZQ-F100 恒溫振蕩培養箱，蘇州培英實驗設備有限公司；NB-1M 磁力攪拌器，蘇州九聯科技有限公司；P230Ⅱ高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器公司；Orbitrap Fusion Lumos 三合一高分辨質譜系統（LC-MS），美國ThermoFisher；Sigma 500 場發射掃描電鏡，德國Carl Zeiss；Sigma 500 能譜儀，德國Bruker；Ultima ⅣX 射線衍射儀，日本理學。

1.2 實驗所用菌種來源

本研究中使用的產乙酸混菌來自實驗室成功馴化與富集的高效產乙酸菌群微生物混合培養物。

1.3 微生物-CdS 耦合系統的構建

將產乙酸混菌接種至自養培養基A 中活化培養至OD600達到0.2 后，接種5%（體積分數）菌液至富集培養基B 中，通合成氣〔V（H2）/V（CO2）=80/20〕5～10 min 后，放置于恒溫振蕩培養箱中培養2 d（180 r/min，30 ℃）。微生物富集后，在通合成氣的同時加入1 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽和1 mmol/L Cd（NO3）2溶液，混合均勻后繼續培養3 d。當菌液由乳白色變為黃色，即表明微生物-CdS 耦合系統成功構建。

1.4 光催化降解實驗

產乙酸混菌-CdS 耦合系統離心棄去上清液后重新分散于裝有自養培養基A 的厭氧瓶（18 mL）中，補充1 g/L 的L-半胱氨酸鹽酸鹽，SMX 質量濃度為2 mg/L，反應液體積為10 mL，在模擬光照（白光燈，波長范圍為442～447 nm，光照強度為50 mW）條件下，將厭氧瓶放置于磁力攪拌器中啟動微生物耦合CdS 光催化降解SMX 實驗。用錫箔紙將厭氧瓶包裹3 層以模擬無光照下微生物降解SMX 的實驗，將微生物滅菌處理以模擬光催化降解SMX 實驗。在反應時間為0、3、6、9、12、24 h 時分別取樣0.5 mL，經0.22 μm 微孔濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀測定SMX 的濃度，采用液相色譜-質譜聯用儀在正負離子模式下檢測SMX 的降解產物。

2 結果與討論

2.1 產乙酸混菌-CdS 耦合系統的合成

產乙酸混菌-CdS 耦合系統的掃描電鏡表征結果如圖1 所示。

圖1 產乙酸混菌-CdS 耦合系統的SEM（a）、（b）和EDS（c）、（d）Fig.1 SEM（a），（b）and EDS（c），（d）of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS

由圖1（a）可見，產乙酸混菌-CdS 耦合系統中存在球形、弧形以及桿狀等形態的細菌，這些細菌表面均勻分布著大量球狀顆粒。由圖1（b）可見，球形顆粒緊密地覆蓋在細菌表面。對這些球形顆粒進行EDS 表征，結果如圖1（c）、1（d）所示，球狀顆粒的主要組成元素為Cd 和S，且比例接近1∶1，初步證實CdS 在產乙酸混菌表面成功合成。

產乙酸混菌-CdS 耦合系統的XRD 分析結果如圖2 所示。

圖2 中26.58°、43.94°和52.08°處出現3 個峰，分別對應于立方體CdS 的（111）、（220）和（311）面，這與標準卡片PDF#42-1411 一致，再次證實CdS 在產乙酸混菌表面成功合成。X 射線衍射峰寬，說明合成的CdS 晶粒尺寸小〔7-8〕。此外，降解SMX 前后產乙酸混菌-CdS 系統的峰形和峰的位置未發生明顯偏移，說明該耦合系統不僅能夠有效降解污染物，而且穩定性高。

圖2 產乙酸混菌-CdS 耦合系統降解SMX 前后的XRDFig.2 XRD of the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS before and after the degradation of SMX

2.2 產乙酸混菌-CdS 耦合系統對SMX 的去除效果

本研究分別在5 個條件下探究了產乙酸混菌-CdS 耦合系統對SMX 的降解效果：①微生物+CdS；②滅活微生物+CdS；③微生物；④光解；⑤吸附。其中，①、②、④在光照條件下，③、⑤在避光條件下展開研究；④為將SMX 溶解在自養培養基A 中后在光照下的降解。反應時間為24 h。結果見圖3。

圖3 產乙酸混菌-CdS 耦合系統在不同條件下對SMX 的降解效率Fig.3 Degradation efficiency of SMX in the system coupling homoacetogenic bacteria and CdS under different conditions

如圖3 所示，24 h 內產乙酸混菌-CdS 耦合系統（微生物+CdS）能夠完全降解SMX，而微生物單獨作用下SMX 的去除率為31%，細菌失活后CdS 光催化劑對SMX 的去除率僅為27%，這初步說明產乙酸混菌在光催化劑降解SMX 過程中發揮了重要作用，產乙酸混菌-CdS 耦合系統顯示出優于單獨CdS 光催化降解或單獨生物降解對SMX 的去除效率。

2.3 CdS 濃度對SMX 降解效果的影響

產乙酸混菌-CdS 耦合系統中CdS 的濃度對SMX 的降解效果和反應速率有顯著的影響，結果如圖4 所示。

圖4 CdS 濃度對SMX 降解效果和反應速率的影響Fig.4 The influence of CdS concentration on the degradation efficiency and reaction rate of SMX

由圖4（a）可 見，當CdS濃度分別為0.5、1、2、4 mmol/L 時，雖然SMX 的去除率均隨時間的延長而增加，但是相同時間內CdS 濃度越高，SMX 去除率越大。CdS 濃度為2 mmol/L 時，反應12 h 后SMX 的去除率便達到95%；而當CdS 濃度提高為4 mmol/L 時，僅9 h 便能夠完全去除SMX。這可能是由于耦合系統中CdS 濃度增加時，水中分散的CdS 光催化劑數量隨之增加，微生物自合成的CdS 在光激發下產生的空穴和活性氧等自由基的數量也相應增加〔9〕，耦合系統中微生物的活性得到加強，因此CdS 濃度的增加顯著提高了產乙酸混菌-CdS 耦合系統對SMX的降解效果。

此外，由圖4（b）可見，SMX 的降解過程均符合一級反應動力學。隨著CdS 濃度的增加，反應速率逐漸增加。CdS 濃度從0.5 mmol/L 提高到1 mmol/L時反應速率的增幅較小，這可能是因為CdS 濃度變化較??；當CdS 濃度從1 mmol/L 提高至2 mmol/L 和4 mmol/L 時，反應速率常數從0.123 5 h-1分別提高至0.221 2 h-1和0.359 h-1，說明耦合系統中CdS 濃度的增加顯著提高了SMX 降解的反應速率。

2.4 微生物耦合CdS 體系降解SMX 機制研究

為了明確微生物耦合CdS 體系降解SMX 的機制，通過液相色譜-質譜聯用（LC-MS）正負離子模式分別對微生物降解、CdS 光催化降解以及微生物耦合CdS 光催化降解SMX 過程中的產物進行檢測及對比，從而推導出SMX 可能的微生物降解路徑、光催化降解路徑以及微生物耦合光催化系統降解途徑。

2.4.1 微生物降解路徑

微生物降解過程中，在正離子模式下保留時間為4.47 min 處檢測到SMX（m/z=254）。依次將正離子模式和負離子模式下檢測出的中間產物命名為B-SMX1～B-SMX9，根據代謝產物的結構特點，提出了微生物降解過程中可能的2 種代謝路徑，如圖5 所示。

有研究表明，細菌體內的2 種Flavin 依賴性單加氧酶（Sad A、Sad B）和FMN 還原酶（Sad C）的基因參與了SMX 的降解過程〔10〕。如圖5 所示，在降解途徑1 中，SMX 首先被還原為產物B-SMX1（4-苯醌-亞胺）和B-SMX3（3-氨基-5-甲基異唑），之后BSMX1 再被還原為產物B-SMX2（對氨基苯酚），而BSMX3 逐漸失去甲基和氨基，生成產物B-SMX5（異唑）。在降解途徑2 中，SMX 結構中的異唑環被破壞，N—O 鍵斷開，生成產物B-SMX6，接著BSMX6 的S—N 鍵斷開生成B-SMX7，B-SMX7 側鏈羥基被取代、斷裂，最終生成產物B-SMX9（苯胺）。這些產物最終經過微生物的作用可能被完全礦化為SO42-、NH4+、NO3-、CO2、H2O 等。

圖5 SMX 在產乙酸混菌作用下的可能降解路徑Fig.5 Possible degradation pathways of SMX by the role of homoacetogenic mixed cultures

2.4.2 光催化降解路徑

光催化降解過程中，在正離子模式下共檢測到9 種產物，依次命名為P-SMX1～P-SMX9。根據降解產物的結構特點，提出了光催化降解SMX 的4 種可能代謝路徑，如圖6 所示。

圖6 SMX 在CdS 光催化作用下的可能降解路徑Fig.6 Possible degradation pathways of SMX by the role of CdS photocatalysis

產物的差異可能是由于光催化材料產生的活性基團攻擊了SMX 不同的結構位置。在E.IOANNIDOU 等〔11〕的研究中，苯環氨基的羥基化和氧化是SMX 主要的轉化途徑，有研究推測，O2·-能夠將磺胺類化合物結構中的氨基氧化為硝基〔12〕。如圖6 所示，在路徑1 中，SMX 苯環上的氨基受到攻擊，被氧化后形成硝基衍生物P-SMX1。在路徑2 中，氨基首先被羥基取代形成產物P-SMX2，之后其異唑環上的甲基受到攻擊，形成P-SMX3。而路徑3 中SMX 的異唑環直接被強氧化性的羥基自由基等活性基團破壞，形成產物PSMX4。在路徑4 中，羥基自由基對磺酰胺鍵的攻擊導致S—N鍵斷裂，直接形成產物P-SMX5和P-SMX6。前3 種路徑下P-SMX1、P-SMX3、P-SMX4 這3 種不同的初級產物，在隨后的降解過程中S—N 鍵被打開，形成對氨基苯磺酸的羥基衍生物P-SMX5 和P-SMX6（3-氨基-5-甲基異唑），這2 種產物再經過進一步的氧化還原過程，可能轉化為P-SMX7、P-SMX8、P-SMX9這3 種產物。

2.4.3 耦合系統降解路徑

產乙酸混菌-CdS 耦合光催化系統在降解SMX 的過程中，不同時間下均檢測到光催化降解途徑的代謝產物，分別將其命名為H-SMX1～H-SMX9，代謝產物隨時間的變化如圖7 所示。

圖7 微生物耦合光催化系統降解SMX 的降解產物豐度隨時間的變化Fig.7 Variation of the abundance of degradation products of SMX with time in the microbial coupled photocatalytic system

由圖7 可知，H-SMX1～H-SMX9 的豐度響應值隨時間發生變化，其中H-SMX3、H-SMX6、H-SMX9是主要的代謝產物，最終的累積豐度在9 種光催化降解產物中占比最高。結合圖6 的光催化降解途徑，SMX 苯環上氨基的羥基化、S—N 鍵的直接斷裂以及甲基的丟失可能是耦合光催化系統中SMX 的主要降解途徑，SMX 在24 h 內大多被轉化為結構較為簡單的代謝產物H-SMX9。

圖8 為單一光催化系統和耦合光催化系統降解SMX 的中間產物的豐度對比。其中，P 代表單一光催化，H 代表耦合光催化，數字1～9 分別代表代謝產物SMX1～SMX9。

圖8 SMX 光催化降解產物豐度在不同條件下隨時間的變化Fig. 8 Variation of the abundance of photocatalytic degradation products of SMX with time under different conditions

如圖8所示，與耦合光催化系統不同的是，單一光催化降解過程的主要降解產物是P-SMX2、P-SMX3、P-SMX6、P-SMX7、P-SMX9。12 h 內單一光催化體系內P-SMX2 的豐度迅速增加，而耦合光催化系統中H-SMX2 的豐度保持較低水平且增長緩慢。24 h 內H-SMX2 丟失甲基的產物H-SMX3 在耦合光催化系統中的豐度比單一光催化體系增加近2 倍，說明微生物的存在可能促進了異唑環上甲基的去除，使H-SMX2向H-SMX3 轉化。此外，產物P-SMX7 在單一光催化體系的降解產物中豐度最高，比耦合光催化系統中H-SMX7的豐度高2個數量級，這可能是由于耦合光催化系統中產乙酸混菌將其轉化為更為簡單的產物甚至完全礦化為CO2、NH3、H2O 等。作為光催化降解過程的末端產物，反應24 h 時3-氨基異唑（H-SMX9）在耦合光催化系統中的豐度是單一光催化降解產物（PSMX9）豐度的2 倍，這說明耦合系統更利于將SMX 降解為結構簡單的代謝產物。

3 結論

通過在細菌表面穩定合成CdS，成功構建了產乙酸混菌-CdS 耦合系統。微生物耦合光催化系統在降解SMX 上的表現優于單一光催化降解或生物降解。提高CdS 濃度能夠顯著提升SMX 的降解效果和反應速率。微生物耦合CdS 系統在降解SMX時同時存在光催化降解和生物降解過程，微生物降解和CdS 光催化協同促進SMX 轉化為結構簡單的產物——3-氨基異唑，發揮了生物降解和光催化降解的雙重優勢。這一系統有望實現PPCPs 污染物的高效降解，探究其對磺胺甲唑的降解機制將為該系統的實際環境應用提供可靠的技術支持，亦可加深研究者對自然界中太陽光驅動作用下礦物與微生物之間相互作用的理論認知。