bHLH轉錄因子在植物抗非生物脅迫基因工程中的應用進展

李君霞 樊永強 代書桃 秦娜 宋迎輝 朱燦燦 王春義 翁鴻燕

摘要：植物在生長發育過程中，經常會遭遇干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的傷害，從而影響其生長發育和地理分布，對于作物而言會降低產量和品質，危害農業生產發展，因此植物抗逆育種研究已經成為保障農業生產的一個重要內容。利用基因工程技術提高植物的抗逆性是一條優于傳統育種途徑的快捷有效的途徑。bHLH轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物生長發育及抵御多種非生物脅迫反應（干旱、高鹽、低溫、缺鐵等）中具有重要的調控作用。有研究者發現，很多bHLH轉錄因子可以提高植物的抗逆性。本文全面系統闡述了植物bHLH轉錄因子的基本結構特征及其在植物抗旱、耐鹽、耐冷、耐缺鐵基因工程中的應用進展，以期為bHLH轉錄因子的利用及植物抗旱遺傳改良和育種提供參考。

關鍵詞：植物;bHLH轉錄因子;抗旱;耐鹽;耐冷;耐缺鐵;基因工程

中圖分類號： S332.1;S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0001-09

收稿日期：2021-08-06

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：nycytx-CARS-06）;河南省農業科學院科技創新團隊項目（編號：2021KJCXTD30）;河南省農業科學院基礎性科研項目（編號：2021JCKY006）。

作者簡介：李君霞（1973—），女，河南禹州人，碩士，副研究員，主要從事雜糧遺傳育種及栽培研究。E-mail：lijunxia@126.com。

通信作者：翁鴻燕，高級農藝師，主要從事丘陵旱地作物研究。E-mail：77069205@qq.com。

植物在生長發育過程中，經常遭遇非生物脅迫（如干旱、高鹽、低溫等），從而影響其生長發育、地理分布，甚至降低產量、品質[1]。為了生存，植物在長期進化過程中逐漸建立了復雜的調節機制以應對環境脅迫[2]。一旦遭遇非生物脅迫，植物體內各種各樣的基因被誘導表達以抵御脅迫傷害。這些基因主要分為2類：調節基因和功能基因，它們的功能主要包括脅迫信號轉導、調控脅迫誘導基因表達和抗逆[1，3]。其中轉錄因子是重要調節基因，在脅迫響應過程中調控靶基因表達以抵御逆境脅迫。目前，在抵御非生物脅迫方面發揮重要作用的轉錄因子家族主要有MYB （v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）、AP2/ERF（APETALA2/ethylene response factor）、NAC [無頂端分生組織（no apical meristem，NAM）、擬南芥轉錄激活因子1（Arabidopsis transcription activation factor 1，ATAF1）、ATAF2、杯狀子葉2（cup-shaped cotyledon 2，CUC2）]、堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）、WRKY、堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）家族等[4-9]。其中，bHLH家族是植物中較大的轉錄因子家族之一，家族成員眾多，亞族非常豐富[10]。擬南芥（A. thaliana）中的bHLH家族成員有162個[11]，水稻（Oryza sativa）中的bHLH家族成員有167個，分為22個亞族，水稻、擬南芥中所有的bHLH轉錄因子分為25個亞族[12];辣椒（Capsicum annuum）中的bHLH家族成員有122個，分為21個亞族[13];黃瓜（Cucumis sativus）中的bHLH家族成員有142個，分為32個亞族[14];菜豆（Phaseolus vulgaris）中的bHLH家族成員有155個，分為21個亞族[15]。bHLH轉錄因子在植物生長發育及抵御干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫方面具有重要調控作用[9]。本文全面系統闡述了植物bHLH轉錄因子結構及在植物抗旱、鹽、冷、缺鐵基因工程中的應用進展，以期為bHLH轉錄因子的利用及植物抗旱遺傳改良和育種提供參考。

1 bHLH轉錄因子的基本結構特征

bHLH轉錄因子因含有高度保守的bHLH結構域而得名[16]。bHLH結構域由60個左右的氨基酸組成，包含2個功能不同的保守區域，分別是位于N末端的通常由13～17個氨基酸組成的堿性區、位于C末端的由近40個氨基酸組成的HLH區[17-19]。堿性區域是DNA結合域，能特異性識別靶基因啟動子區中的E-box（5′-CANNTG-3′）[20]，E-box中間的2個核苷酸可變，最常見的是回文G-box （5′-CACGTG-3′）[12]。HLH區參與同源或異源二聚體的形成，通過堿性區與DNA結合，調控下游靶基因的表達[21]。

2 bHLH轉錄因子在植物抗非生物脅迫基因工程中的應用進展

bHLH轉錄因子家族成員眾多，且不同成員對非生物脅迫逆境的反應程度不同，有的成員能夠提高植物對干旱、高鹽、低溫、缺鐵等單一環境脅迫的抗性，有的成員可以同時提高植物對2種及以上環境脅迫的抗性，甚至提高籽粒產量。

2.1 單一抗性

2.1.1 抗旱 擬南芥脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導的bHLH轉錄因子編碼基因（ABA-inducible bHLH-type transcription factor，AtAIB） 受ABA和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）誘導表達。敲除AtAIB基因的擬南芥植株對ABA的敏感性降低;超表達AtAIB基因的擬南芥植株對ABA的敏感性增強，且在土培干旱條件下，其存活率是野生型對照的2倍、敲除AtAIB基因植株的2.7倍，表現出一定的抗旱性[22]。由此可見，AtAIB可以調控ABA信號傳遞，進而提高轉基因植株的抗旱性。AtbHLH68基因受干旱誘導表達，與野生型對照相比，超表達該基因的擬南芥植株生長緩慢且植株矮小，主根長顯著變短且呈淡黃色，側生根數顯著減少，ABA含量顯著增加;在干旱條件下，超表達AtbHLH68基因的植株綠葉率高，生長狀態好，抗旱性提高。分析表達情況發現，超表達AtbHLH68基因的植株中ABA代謝基因[擬南芥醛氧化酶3基因（Arabidopsis aldehyde oxidase 3，AAO3）]、ABA相關的干旱脅迫響應基因 [v-myc禽髓細胞瘤病病毒癌基因同源物2基因 （v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog 2，MYC2）、bHLH122基因、脫水響應29A基因 （responsive to dehydration 29A，RD29A）]的表達量顯著提高，側根發育基因[ABA敏感3基因（ABA insentive 3，ABI3）]的表達量顯著降低[23]。說明AtbHLH68可以調控側根伸長，并通過ABA依賴途徑調控ABA信號傳遞，進而提高植物的抗旱性。

除了從模式植物擬南芥中分離獲得可以提高植物抗旱性的bHLH基因外，研究者還陸續從胡楊（Populus euphratica）、苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）、蘋果（Malus domestica）中分離獲得可以提高植株抗旱性的bHLH基因。PebHLH35基因受干旱和ABA誘導表達，例如，在擬南芥中超表達胡楊PebHLH35基因后，在正常條件下，轉基因植株主根長較空載體對照變長，且葉片增多、葉面積增加;在干旱條件下，超表達PebHLH35基因的植株萎蔫率較空載體對照降低55%，復水后存活率高達60%，而空載體對照全部死亡，表現出很強的抗旱性。進一步分析發現，超表達PebHLH35基因的植株氣孔密度、氣孔開度、蒸騰速率、失水率均顯著降低，葉綠素含量和光合速率均顯著提高，且氣孔調控相關基因[磷脂酶C1（phospholipase C1，PLC1）]的表達量顯著提高[24]。說明PebHLH35基因通過調控氣孔密度、開度及光合作用來積極響應干旱脅迫。FtbHLH3基因主要受聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、ABA誘導表達。有研究發現，超表達苦蕎麥FtbHLH3基因顯著提高了擬南芥植株在干旱條件下的存活率，這主要歸因于轉基因植株中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、離子滲漏率、活性氧 （reactive oxygen species，ROS）（如H2O2、O-2·） 積累量減少，脯氨酸含量、抗氧化酶[過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）]活性、光合效率提高。表達分析結果顯示，在干旱條件下，轉基因植株中多個脅迫響應基因[單脫水抗壞血酸還原酶基因（monodehydroascorbate reductase，MDAR）、乙醛脫氫酶3家族H基因 （Aldehyde dehydrogenase 3 family，member H，ALDH3H）、MYC2基因、早期脫水響應4基因（early responsive to dehydration 4，ERD4）、CAT基因、SOD基因、九順式環氧蛋白質雙加氧酶基因 （nine-cis epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）、Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶 5基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS）]的表達量均較野生型對照顯著提高，其中NCED是ABA合成的限速酶基因[25]，說明FtbHLH3通過ABA依賴途徑提高了轉基因植株的抗旱性。蘋果MdbHLH130基因受脫水脅迫影響而強烈誘導表達，超表達MdbHLH130基因的蘋果愈傷組織對PEG脅迫表現出很強的抗性，且超表達MdbHLH130基因的煙草（Nicotiana tabacum）植株在干旱條件下的發芽率、根長均顯著增加，存活率較野生對照提高3.0～4.7倍。進一步分析發現，超表達MdbHLH130基因的煙草植株由ABA誘導的氣孔關閉度、葉片失水率、電解質滲漏、MDA含量、ROS積累量均顯著降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性顯著增加，而ROS清除基因（SOD、POD、CAT）和脅迫響應基因[脫水響應元件結合蛋白3基因（dehydration-responsive-element-binding protein，DREB3）、ERD10C基因、ERD10D基因、NCED1基因、晚期胚胎豐富蛋白5基因 （late-embryogenesis-abundant protein 5，LEA5）、脂轉移蛋白1基因 （lipid-transfer protein 1，LTP1）]的表達量顯著提高[26]。說明MdbHLH130可以通過調節氣孔關閉和ROS清除來提高轉基因植株的抗旱性。

2.1.2 耐鹽 目前，關于bHLH基因僅僅響應植物高鹽脅迫的報道較少。Zhou等從野生稻（Oryza rufipogon）中分離了OrbHLH2基因，發現在擬南芥中超表達該基因提高了轉基因植株的耐鹽性。在高鹽條件下，超表達OrbHLH2基因植株的種子萌發率較野生型對照提高了54.5%～69.7%，且脅迫響應基因[C重復結合轉錄因子3基因 （C-repeat binding transcription factor 3，CBF3）、RD29A、冷調控15A基因 （cold regulated 15A，COR15A）、激酶1基因 （kinase 1，KIN1）]的表達量提高[27]。對野生型對照和超表達OrbHLH2基因的植株進行ABA處理后發現，兩者在種子萌發和脅迫響應基因表達方面的表現均相似，說明OrbHLH2基因對鹽脅迫的響應不依賴于ABA。Zheng等發現，bHLH轉錄因子家族多效唑抗性基因 （paclobutrazol resistances，PREs）在ABA處理下的表達量降低，在高鹽脅迫條件下的表達量提高[28]。有研究發現，在擬南芥中超表達PREs基因提高了轉基因植株的耐鹽性，而pre6突變體的耐鹽性與野生型對照相比無明顯變化;超表達PREs基因的擬南芥植株對ABA的敏感性提供，而pre6突變體對ABA的敏感性降低，說明PREs在調控高鹽脅迫方面是功能性冗余的。bHLH轉錄因子家族成員眾多，功能也不盡相同，有的bHLH轉錄因子正調控植物的耐鹽性，有的bHLH轉錄因子負調控植物的耐鹽性。Verma發現，在擬南芥中超表達bHLH轉錄因子編碼基因AtMYC2后，轉基因植株對高鹽脅迫的耐受性降低，脯氨酸含量與野生型對照相比無顯著差異;而myc2突變體對高鹽脅迫的耐受性增強，且脯氨酸含量顯著增加[29]。進一步分析發現，在高鹽條件下，myc2突變體中P5CS1基因表達量顯著提高，在超表達MYC2基因植株中，P5CS1基因表達量無顯著變化，這是因為MYC2轉錄因子可與P5CS1基因的5′非翻譯區（UTR）結合，進而調控P5CS1基因的表達。綜上，MYC2轉錄因子負調控P5CS1基因的表達，進而負調控脯氨酸的合成，可以通過沉默MYC2基因表達來提高植株的耐鹽性。

2.1.3 耐冷 bHLH轉錄因子家族中響應低溫脅迫的成員以CBF表達誘導因子 （inducer of CBF expression 1，ICE1）為主，ICE1是類似MYC的bHLH轉錄因子，直接結合并激活DREB1/CBF基因的表達，以調控低溫響應。在擬南芥中超表達水稻OsICE1、OsICE2基因（與AtICE1序列高度相似）后，會提高轉基因植株的耐冷性和冷響應基因（RD29A、COR15A、COR47）的表達量。進一步分析發現，OsICE1和OsICE2轉錄因子與冷適應關鍵轉錄因子OsMYBS3互作[30]，表明OsICE1、OsICE2轉錄因子通過調控冷響應基因的表達來調控植物的耐冷性。類似的，龍眼（Dimocarpus longan Lour.） DlICE1基因、茄子（Solanum melongena）SmICE1a基因均受冷脅迫誘導表達，在擬南芥中分別超表達這2個基因均會提高轉基因植株的耐冷性，這主要得益于轉基因植株的脯氨酸含量提高，離子滲漏量、MDA含量和ROS積累量降低，且一些ICE1-CBF冷信號途徑基因（AtCBF1/2/3）、冷響應基因（AtRD29A、AtCOR15A、AtCOR47、AtKIN1）表達量顯著提高[31-32]。另外，枸橘（Poncirus trifoliata）PtrICE1基因受冷、脫水、高鹽誘導表達，尤其是冷條件;PtrICE1可與精氨酸脫氫酶（arginine decarboxylase，PtADC）互作。在煙草或者檸檬（Citrus limon）中超表達PtrICE1基因提高了轉基因植株的耐冷、耐凍性。在低溫脅迫條件下，超表達PtrICE1基因的植株ADC基因表達量、多胺含量、葉綠素含量及抗氧化酶SOD、CAT活性提高，離子滲漏、活性氧積累量降低[33]。說明PtrICE1轉錄因子通過與ADC基因結合來調控多胺水平，進而調控植物的耐冷性。

除了ICE1基因外，還有些bHLH基因也能提高植物的耐冷性。例如，PtrbHLH基因受多種非生物脅迫誘導表達，尤其是冷，可與POD基因的E-box元件結合。在煙草、檸檬、柚子（C. grandis）中分別超表達PtrbHLH基因后，均提高了轉基因植株的耐冷性，通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術下調該基因在枸橘中的表達量發現，枸橘對冷的敏感性增強。與野生型對照相比，超表達PtrbHLH基因的植株離子滲漏量、MDA含量、ROS積累量降低，抗氧化酶（CAT、POD、SOD）活性及抗氧化酶（CAT、POD、SOD）編碼基因表達量升高，RNAi植株相反。且外施POD抑制劑提高了超表達PtrbHLH基因植株的H2O2含量，降低了其耐冷性，外施POD抑制劑提高了RNAi植株的耐冷性[34-35]。由此可見，超表達PtrbHLH基因植株耐冷性的提高在一定程度上歸因于其對ROS清除能力的提高。類似的，甜橙（C. sinensis）CsbHLH18基因也可與CsPOD基因啟動子區特異性結合。在煙草中超表達CsbHLH18基因也提高了轉基因植株的耐冷性。在冷脅迫條件下，與野生型對照相比，超表達CsbHLH18基因植株的ROS積累量降低，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表達水平提高。相反的，敲除bHLH18基因的植株對冷的敏感性增強，SOD、POD、CAT活性及SOD、POD、CAT基因表達水平降低，ROS積累量提高[36]。由此可見，CsbHLH18對植物耐冷性的提高在一定程度上是通過直接調控抗氧化基因的表達進而調控ROS平衡來實現的。另外，NtbHLH123基因受冷脅迫誘導，在煙草中超表達NtbHLH123基因后，在冷脅迫條件下，轉基因植株的存活率為39.3%～59.6%，而野生型對照的存活率僅為10.0%。進一步分析發現，NtbHLH123轉錄因子與 NtCBF 基因啟動子區的 G-box/E-box元件結合，直接正調控其表達;在冷脅迫條件下，與野生型對照相比，超表達NtbHLH123基因植株的離子滲漏量、MDA含量、ROS積累量降低，一些ROS清除基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及其他脅迫響應基因（NtLEA5、NtERD10C、NtERD10D）的表達量提高[37]。由此可見，NtbHLH123轉錄因子通過調控NtCBF、ROS清除相關基因、脅迫響應基因來提高植物的耐冷性。

2.1.4 耐缺鐵性 Zhang等發現，敲除AtbHLH104基因的擬南芥植株耐缺鐵性大大降低，幼嫩葉片中的鐵含量較野生型對照降低了15.5%，成熟葉片中鐵含量沒有差異;相反的，超表達AtbHLH104基因擬南芥植株耐缺鐵性增強，幼嫩葉片、成熟葉片、花、籽粒中的鐵含量均較野生型對照顯著增加，同時鐵蛋白1基因 （ferritin1，FER1）表達量提高[38]。進一步分析發現，AtbHLH104可與IVc亞組bHLH轉錄因子吲哚乙酸-亮氨酸抗性3（IAA-Leucine resistant 3，ILR3）互作，且超表達AtILR3基因的擬南芥植株耐缺鐵性也增強。另外，AtbHLH104和AtILR3均可與鐵脅迫響應調控基因Ib亞組bHLH基因和PYE（POPEYE）基因啟動子區的E-Box元件結合，進而調控這2條轉錄調控途徑。由此可見，AtbHLH104和AtILR3均可通過調控Ib亞組bHLH基因和AtPYE基因來調控植物的鐵脅迫響應。

除了在模式植物擬南芥中發現提高植物耐缺鐵性的bHLH基因外，研究者已經陸續從山楊（Populus tremula）、蘋果、大豆（Glycine max）、水稻中也發現了提高植物耐缺鐵性的bHLH基因。山楊FER 類鐵缺乏誘導轉錄因子1基因 （FER-like iron deficiency-induced transcription factor 1，FIT）受缺鐵脅迫誘導表達，超表達PtFIT基因提高了轉基因山楊植株的耐缺鐵性。在缺鐵脅迫條件下，轉基因植株葉綠素含量及葉綠素a/b較野生型對照顯著提高[39]。蘋果MdbHLH104受缺鐵誘導表達，超表達MdbHLH104基因提高了缺鐵條件下蘋果植株質膜H+-ATPase活性和耐缺鐵性，這是因為MdbHLH104轉錄因子可與MdAHA8（autoinhibited H+-ATPases 8）基因啟動子區結合，調控其表達，進而調控缺鐵條件下質膜H+-ATPase活性和鐵吸收[40]。另外，同時超表達大豆GmbHLH57和GmbHLH300基因也提高了轉基因植株的耐缺鐵性，轉基因植株中鐵吸收基因[鐵還原酶氧化酶基因（ferric reductase oxidase 2，FRO2）、鐵調控轉運基因（iron-regulated transporter，IRT1）]表達量和鐵含量均提高[41]。眾所周知，水稻OsHRZ1（haemerythrin motif-containing really interesting new gene （RING）-and zinc-finger protein 1）和 OsHRZ2轉錄因子負調控缺鐵響應。Kobayashi等發現，OsbHLH058轉錄因子可與 OsHRZ1、OsHRZ2蛋白互作，超表達OsbHLH058基因水稻植株耐缺鐵性增強，且缺鐵條件下轉基因植株種子中鐵含量升高，缺鐵誘導基因[煙酰胺合成酶1基因（niacinamide synthetase 1，NAS1）、麥根酸家族植物鐵載體轉運1基因 （transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1，TOM1） 、類黃色條紋蛋白15基因（yellow stripe-like protein 15，YSL15）]、OsIRT1的表達量提高[42]。相反的，敲除OsbHLH058基因的水稻植株對缺鐵敏感性增強，鐵誘導基因的表達量降低[42]，說明OsbHLH058轉錄因子正調控缺鐵響應，在一定程度上受到OsHRZ控制。

2.2 復合抗性

2.2.1 抗旱+耐鹽 擬南芥AtbHLH92基因受鹽、脫水、甘露醇、冷誘導表達。超表達AtbHLH92基因增加了轉基因擬南芥植株的根長、側根數，促進了轉基因植株的生長，提高了脅迫響應基因[COR47、Ⅲ類過氧化物酶10基因（class Ⅲ peroxidases，PER10）、PER52基因、PER59基因]的表達量，增強了轉基因植株的耐鹽性、抗旱性，而Atbhlh92突變體對高鹽、干旱的敏感性增強[43]。類似的，AtbHLH112基因受干旱、高鹽、ABA誘導表達，AtbHLH112轉錄因子可與脅迫響應基因啟動子區的E-box元件、GCG元件結合，超表達該基因提高了擬南芥植株的抗旱性和耐鹽性，反之，沉默該基因增強了轉基因擬南芥植株對干旱、高鹽的敏感性。與野生型對照相比，超表達AtbHLH112基因提高了轉基因植株中P5CS基因的表達量，降低了Δ1-吡咯啉-5羧酸鹽脫氫酶基因（Δ1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase，P5CDH）和脯氨酸脫氫酶基因（proline dehydrogenase，ProDH）的表達量，進而提高了轉基因植株的脯氨酸含量;同時，超表達AtbHLH112基因提高了轉基因植株POD、SOD基因表達量及POD、SOD活性，最終提高了轉基因植株對ROS的清除能力[44]。由此可見，AtbHLH112轉錄因子通過與E-box元件、GCG元件結合來調控基因的表達，進而調控脯氨酸合成和ROS清除，最終調控植物的抗逆性。

除了在模式植物擬南芥中發現能夠同時提高植物抗旱、耐鹽性的bHLH基因外，研究者還從剛毛檉柳（Tamarix hispida）、金魚草（Antirrhinum majus）、密羅木（Myrothamnus flabellifolia）、龍爪稷（Eleusine coracana L.）中發現了可以同時提高植物抗旱性、耐鹽性的bHLH基因。例如，剛毛檉柳ThbHLH1基因受高鹽、ABA、甘露醇誘導表達，與G-box特異性結合以響應高鹽、甘露醇脅迫，在擬南芥中超表達該基因提高了轉基因植株的耐鹽性和抗旱性。與野生型對照相比，在高鹽和干旱條件下，轉基因植株中的甜菜堿、脯氨酸含量與Ca2+濃度、POD活性、SOD活性均提高，MDA含量、ROS積累量及細胞死亡率降低。究其原因，ThbHLH1轉錄因子調控P5CS基因、甜菜堿醛脫氫酶基因（betaine-aldehyde dehydrogenase，BADH）、POD基因、SOD基因、LEA基因、熱激蛋白基因（heat shock protein，HSP）等抗逆基因的表達[45]。由此可見，ThbHLH1轉錄因子通過調控抗逆相關基因的表達來提高轉基因植株的滲透壓、ROS清除能力，進而提高轉基因植株的耐鹽性和抗旱性。另外，超表達金魚草bHLH轉錄因子編碼基因AmDEL（Delila）提高了轉基因擬南芥植株類黃酮積累量及抗旱、耐鹽性。與野生型對照相比，在干旱和高鹽條件下，超表達AmDEL基因顯著增加了轉基因植株脯氨酸含量、相對含水量，降低了MDA、H2O2含量，且提高了類黃酮合成基因[苯丙基氨酸解氨酶基因 （phenylalanine ammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構酶基因（chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮-3-羥化酶基因（flavanone-3-hydroxylase，F3H）、 黃酮醇合成酶基因（flavonol synthase，FLS）、黃烷酮醇還原酶基因（dihydroflavonol reductase，DFR）]、P5CS基因、ROS清除基因（SOD、POD）的表達量，提高了PAL、CHI、DFR、P5CS、SOD、POD活性[46-47]。說明AmDEL基因通過調控類黃酮合成基因、抗氧化酶基因的表達來調控植株的抗逆性。此外，密羅木 bHLH家族成員光敏色素互作因子1基因（phytochrome-interacting factor 1，PIF1）和MfbHLH38基因均受脫水誘導表達，在擬南芥中分別超表達這2個基因后，均提高了轉基因植株的抗旱性和耐鹽性，這主要歸因于轉基因植株葉綠素、脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的提高以及葉片失水率、MDA含量、ROS積累量的降低。另外，超表達MfPIF1 基因降低了干旱和高鹽脅迫條件下轉基因植株的氣孔開度，提高了ABA含量及ABA合成與響應基因（NCED3、P5CS、RD29A）的表達量[48-49]。由此可見，MfPIF1和MfbHLH38轉錄因子通過提高植物保水、滲透調節能力，降低了脅迫誘導的氧化傷害，通過參與依賴于ABA的脅迫響應途徑來提高植株的抗旱性和耐鹽性。

有些bHLH基因不僅能提高植物的抗逆性，還能提高產量，這些bHLH基因在作物抗逆遺傳改良中具有更重要的作用。例如，龍爪稷EcbHLH57基因受ABA、高鹽、干旱誘導表達，超表達該基因促進了煙草植株根系發育（根長顯著變長），提高了轉基因植株的耐鹽性和抗旱性。在干旱條件下，超表達EcbHLH57基因提高了轉基因植株的光合速率和氣孔導度，進而增加了生物量;在長期高鹽脅迫條件下，超表達EcbHLH57基因提高了轉基因植株單果莢種子質量和果莢數。通過對表達情況進行分析發現，超表達cbHLH57基因提高了轉基因植株中脅迫相關基因[LEA14基因、rd29A基因、rd29B基因、SOD基因、APX基因、乙醛脫氫酶基因（alcohol dehydrogenase 1，ADH1）、HSP70基因 、磷酸酶2C基因（phosphatases 2C，PP2C）]的表達量，進而提高了LE轉基因植株的抗逆性[50]。

2.2.2 耐鹽+耐冷 野生稻OrbHLH001基因是類ICE1基因，受高鹽誘導表達，在擬南芥中超表達該基因提高了轉基因植株的耐鹽性和耐冷性。與野生型對照相比，轉基因植株中冷脅迫誘導基因（ICE1、 CBF1、CBF2、CBF3、RD29A、COR47）的表達量無差異[51]，說明OrbHLH001基因與ICE1基因有所不同，不依賴于CBF/DREB1冷響應途徑。類似的，番茄（Solanum lycopersicum） SlICE1a基因受冷、高鹽誘導表達，在煙草中超表達SlICE1a基因提高了轉基因植株的耐冷性和耐鹽性。與野生型對照相比，轉基因植株的脯氨酸、可溶性糖、LEA含量增加，離子滲漏、MDA含量降低，脅迫響應基因（NtDREB2、NtERD10B、NtERD10C、NtERD10D、NtLEA5、NtP5CS）的表達量提高[52]，說明SlICE1a轉錄因子通過上調脅迫響應基因的表達量來提高植物的耐冷性和耐鹽性。

2.2.3 抗旱+耐鹽+耐冷 有些bHLH基因可以同時提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐冷性，甚至提高產量。例如，小麥TabHLH39基因受干旱、高鹽、冷誘導表達，在擬南芥中超表達該基因提高了轉基因植株的抗旱性、耐鹽性與耐冷性。與野生型對照相比，超表達TabHLH39基因植株在干旱、高鹽、冷脅迫條件下的存活率提高，可溶性糖、脯氨酸含量增加，離子滲漏降低，且脅迫響應基因[滲透響應高表達1基因（high expression of osmotically responsive 1，HOS1）、DRIP2、ERD6、AtICE1、RD29A、RD22、ERD1]的表達量提高[53]。結縷草（Zoysia japonica）ZjICE2基因也受冷、高鹽、干旱誘導表達，可與ZjDREB1基因啟動子區的MYC順式元件結合，超表達該基因提高了轉基因擬南芥、結縷草植株耐冷、抗旱、耐鹽性。與野生型對照相比，在冷脅迫下，轉基因植株的抗氧化酶（POD、SOD）活性和脯氨酸含量提高，MDA含量降低，冷脅迫響應基因（CBF1、CBF2、CBF3、COR47A、KIN1、RD29A）表達量提高;在干旱條件下，轉基因植株葉綠素含量提高，氣孔開度和MDA含量降低;在鹽脅迫條件下，轉基因植株葉面積指數和葉綠素含量提高[54]。類似的，超表達油菜（Brassica campestris）BcICE1基因也可提高煙草植株的耐冷性、耐鹽性與抗旱性。在冷、高鹽、干旱條件下，轉基因植株的SOD、CAT、POD、APX活性及脯氨酸、可溶性糖、葉綠素含量增加，相對電導率和MDA含量降低，抗氧化酶基因（NtSOD、NtCAT、NtPOD）及脅迫響應基因（NtCBF1、NtCBF3、NtDREB2B、NtERD10B、NtERD10C）的表達量提高[55]。另外，超表達菊花（Chrysanthemum dichrum）CdICE1基因也提高了菊花植株的耐冷性、抗旱性、耐鹽性，與野生型對照相比，超表達CdICE1基因植株在冷、干旱、高鹽條件下的存活率分別提高了69.6%、123.3%、56.7%;CgDREBa、CgDREBb基因表達量提高，SOD、POD活性及脯氨酸含量增加[56]。

值得注意的是，在水稻中超表達AtICE1基因不僅提高了轉基因植株耐冷、抗旱、耐鹽性，還提高了水稻產量。在冷、高鹽、干旱條件下，轉基因植株小穗育性增強，籽粒產量分別較野生型對照顯著提高了58%～214%、110%～220%、44%～66%。與野生型對照相比，在冷脅迫條件下，轉基因植株的MDA、H2O2含量降低，膜穩定性增強，脅迫響應基因[OsDREB1A、OsMYB3R2、OsTPP1（trehalose-6-phosphate phosphatase ）]的表達量提高。在干旱脅迫條件下，轉基因植株光合速率、氣孔導度、水分利用效率提高，說明AtICE1通過提高脅迫響應基因的表達量、ROS清除能力、膜穩定性、水分利用效率等來提高植物的抗逆性[57]。

2.2.4 其他 bHLH基因除了可以綜合提高植物的抗旱、耐鹽、耐冷性，還可以綜合提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐缺磷性與耐缺氮性。玉米（Zea mays）bHLH家族磷饑餓誘導轉錄因子1（Pi starvation induced transcription factor 1，PTF1）受低磷、ABA、PEG誘導表達，尤其在根部。Li等首先發現，超表達ZmPTF1基因可以提高轉玉米植株的耐缺磷性。表型表現為轉基因植株根系發育健壯，籽粒變大，穗長、行粒數、籽粒百粒質量增加[58]。與野生型對照相比，轉基因植株根系可溶性糖含量提高，葉片可溶性糖含量降低，參與蔗糖合成的果糖-1，6-二磷酸酶、蔗糖磷酸合成（SPS1）基因表達量在葉片中提高，在根系中降低;參與蔗糖分解代謝的蔗糖轉化酶基因表達量在根中降低。后來，Li等進一步研究發現，超表達ZmPTF1基因還可以提高玉米植株的抗旱性，表型表現為轉基因玉米植株根數、根長增加，尤其是側根，更值得注意的是，籽粒產量較野生型對照提高了147%。這在一定程度上是因為ZmPTF1轉錄因子可與NCED、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30基因啟動子區的G-box元件結合，并且正調控這些基因的表達[59]。其中，NCED基因是ABA合成限速酶基因，ZmPTF1轉錄因子通過上調NCED基因表達量來促進ABA合成，激活ABA信號通路，轉基因植株中依賴于ABA的脅迫響應被激活。綜上，ZmPTF1轉錄因子通過促進根系發育、ABA積累與激活ABA、CBF4、ATAF2/NAC081、NAC30介導的脅迫響應來提高轉基因植株的抗逆性。

TabHLH1基因受干旱、高鹽、缺磷、缺氮脅迫誘導表達。Yang等首先發現，在煙草中超表達TabHLH1基因可以提高轉基因植株的抗旱性和耐鹽性[60]。在干旱、高鹽條件下，與野生型對照相比，轉基因植株的生物量增加，葉片失水率降低，氣孔關閉快，脯氨酸和可溶性糖含量提高，H2O2含量減少，且轉基因植株中ABA受體類吡喃巴丁抗性12基因（Pyrabatin riesistance like 12，PYL12）及蔗糖非發酵相關蛋白激酶2（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2，SnRK2）家族應急激活蛋白激酶2;1基因（stress-activated protein kinase 2;1，SAPK2;1）的表達量提高。超表達NtPYL12、NtSAPK2;1基因促進了干旱和高鹽脅迫條件下轉基因植株氣孔關閉，降低了葉片失水率，進而促進了轉基因植株生長。在缺磷、缺氮條件下，與野生型對照相比，轉基因植株株型大，生物量及磷、氮濃度增加，磷酸鹽轉運1基因（phosphate transporter 1，PT1）、硝酸鹽轉運2.2基因（nitrate transporter 2.2，NRT2.2）的表達量提高。另外，轉基因植株的ROS積累量降低，抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性及NtSOD1、NtCAT1、NtPOD1;6基因的表達量提高[61]。綜上，TabHLH1通過ABA依賴途徑調控植物的抗旱性和耐鹽性，通過調控磷酸鹽轉運蛋白基因、硝酸鹽轉運蛋白基因、抗氧化酶基因來調控植物的耐缺磷性和耐缺氮性。

3 展望

植物在生長發育過程中經常遭遇非生物脅迫危害，其中干旱、高鹽、低溫是主要的非生物脅迫，會嚴重影響植物生長、地理分布，甚至是作物產量和品質。因此，提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐冷性對農業生產意義重大。然而，植物的抗逆性狀是復雜的數量性狀，受多基因控制，易受環境影響，因此通過常規育種技術有效選育抗逆品種較難?；蚬こ碳夹g是培育抗逆品種的有效途徑，相比傳統的常規育種，基因工程育種有其獨特的優勢，不僅基因來源廣泛，而且能夠實現對特定性狀精確高效的改良，有廣闊的應用前景。bHLH家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物抵御干旱、高鹽、低溫、缺鐵脅迫反應中具有重要的調控作用。目前，bHLH轉錄因子在擬南芥、煙草及水稻、玉米、大豆等植物抗逆基因工程中的應用取得了一定的進展，研究者已經成功獲得了一些轉基因抗逆材料和抗逆候選bHLH基因，尤其是可以提高籽粒產量的bHLH基因，例如提高煙草種子產量的EcbHLH57基因、提高水稻籽粒產量的AtICE1基因，為作物抗逆遺傳改良及育種奠定了堅實的基礎。但是該領域目前還存在一些問題亟須解決：第一，轉基因植物的抗逆性大部分是在室內、苗期鑒定的，但是室內模擬環境與大田環境不同，大田環境受影響的因素較多，另外，苗期抗逆生殖生長期不一定抗逆，因此應在大田、生殖生長期進行二次抗逆性鑒定。第二，抗逆性是復雜的多基因控制的數量性狀，一般轉單個抗逆基因植株的抗逆性提高幅度有限，甚至不能提高抗逆性，因此應加速多基因（尤其是調節基因）共同導入植物的系統研究，以提高轉基因植物的抗逆性。第三，轉基因植株中大多數bHLH基因是組成型超表達的，在提高轉基因植株抗逆性的同時可能會造成生長緩慢、開花推遲等，故建議對bHLH基因進行脅迫誘導超表達，在提高轉基因植株抗逆性的同時也不會影響生長發育。

參考文獻：

[1]Xiong L，Schumaker K S，Zhu J K. Cell signaling during cold，drought，and salt stress[J]. The Plant Cell，2002，14：165-183.

[2]Nakashima K，Ito Y，Yamaguchi-Shinozaki K. Transcriptional regulatory networks in response to abiotic stresses in Arabidopsis and grasses[J]. Plant Physiology，2009，149：88-95.

[3]Todaka D，Shinozaki K，Yamaguchi-Shinozaki K. Recent advances in the dissection of drought-stress regulatory networks and strategies for development of drought-tolerant transgenic rice plants[J]. Frontiers in Plant Science，2015（6）：84.

[4]Wu J D，Jiang Y L，Liang Y N，et al. Expression of the maize MYB transcription factor ZmMYB3R enhances drought and salt stress tolerance in transgenic plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2019，137：179-188.

[5]Djemal R，Khoudi H. The barley SHN1-type transcription factor HvSHN1 imparts heat，drought and salt tolerances in transgenic tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2021，164：44-53.

[6]Yarra R，Wei W. The NAC-type transcription factor GmNAC20 improves cold，salinity tolerance，and lateral root formation in transgenic rice plants[J]. Funct Integr Genomics，2021，21（3/4）：473-487.

[7]He Q，Cai H Y，Bai M Y，et al. A soybean bZIP transcription factor GmBZIP19 confers multiple biotic and abiotic stress responses in plant[J]. International Journal of Molecular Science，2020，21（13）：4701.

[8]Ye H，Qiao L Y，Guo H Y，et al. Genome-Wide identification of wheat WRKY gene family reveals that TaWRKY75-A is referred to drought and salt resistances[J]. Frontiers in Plant Science，2021，12：663118.

[9]Hao Y Q，Zong X M，Ren P，et al. Basic helix-loop-helix （bHLH） transcription factors regulate a wide range of functions in Arabidopsis[J]. Int J Mol Sci，2021，22（13）：7152.

[10]Roig-Villanova I，Bou-Torrent J，Galstyan A，et al. Interaction of shade avoidance and auxin responses：a role for two novel atypical bHLH proteins[J]. EMBO J，2007，26（22）：4756-4567.

[11]Bailey P C，Martin C，Toledo-Ortiz G，et al. Update on the basic helix-loop-helix transcription factor gene family in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell. 2003，15（11）;2497-2502.

[12]Li X X，Duan X P，Jiang H X，et al. Genome-wide analysis of basic/helix-loop-helix transcription factor family in rice and Arabidopsis[J]. Plant Physiol，2006，141（4）：1167-1184.

[13]Zhang Z S，Chen J，Liang C L，et al. Genome-wide identification and characterization of the bHLH transcription factor family in pepper （Capsicum annuum L.）[J]. Frontiers in Genetics，2020，11：1156.

[14]Li J，Wang T，Han J，et al. Genome-wide identification and characterization of cucumber bHLH family genes and the functional characterization of CsbHLH041 in NaCl and ABA tolerance in Arabidopsis and cucumber[J]. BMC Plant Biol，2020，20：272.

[15]Kavas M，Baloglu M C，Atabay E S，et al. Genome-wide characterization and expression analysis of common bean bHLH transcription factors in response to excess salt concentration[J]. Mol Genet Genomic，2016，291：129-143.

[16]Feller A，Machemer K，Braun E L，et al. Evolutionary and comparative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors[J]. Plant J，2011，66（1）：94-116.

[17]Kong Q，Pattanaik S，Feller A，et al L. Regulatory switch enforced by basic helix-loop-helix and ACT-domain mediated dimerizations of the maize transcription factor R[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（30）：E2091-E2097.

[18]Pires N，Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants[J]. Molecular Biology and Evolution，2010，27（4）：862-874.

[19]Filiz E，Vatansever R，Ozyigit I I. Dissecting a co-expression network of basic helix-loop-helix （bHLH） genes from phosphate （Pi）-starved soybean （Glycine max）[J]. Plant Gene，2017，9：19-25.

[20]Pires N，Dolan L. Origin and diversification of basic-helix-loop-helix proteins in plants[J]. Molecular Biology and Evolution，2010，27（4）：862-874.

[21]Murre C，Bain G，van Dijk M A，et al. Structure and function of helix-loop-helix proteins[J]. Biochim Biophys Acta-Gene Struct Expr，1994，1218（2）：129-135.

[22]Li H M，Sun J Q，Xu Y X，et al. The bHLH-type transcription factor AtAIB positively regulates ABA response in Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol，2007，65（5）：655-665.

[23]Le H R，Castelain M，Chakraborti D，et al. AtbHLH68 transcription factor contributes to the regulation of ABA homeostasis and drought stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J]. Physiol Plant，2017，160（3）：312-327.

[24]Dong Y，Wang C P，Han X，et al. A novel bHLH transcription factor PebHLH35 from Populus euphratica confers drought tolerance through regulating stomatal development，photosynthesis and growth in Arabidopsis[J]. Biochem Biophys Res Commun，2014，450（1）：453-458.

[25]Yao P F，Li C L，Zhao X R，et al. overexpression of a tartary buckwheat gene，FtbHLH3，enhances drought/oxidative stress tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Front Plant Sci，2017，8：625.

[26]Zhao Q，Fan Z，Qiu L，et al. MdbHLH130，an apple bHLH transcription factor，confers water stress resistance by regulating stomatal closure and ROS homeostasis in transgenic tobacco[J]. Front Plant Sci，2020，11：543696.

[27]Zhou J，Li F，Wang J L，et al. Basic helix-loop-helix transcription factor from wild rice （OrbHLH2） improves tolerance to salt-and osmotic stress in Arabidopsis[J]. J Plant Physiol，2009，166（12）：1296-1306.

[28]Zheng K J，Wang Y T，Wang S C. The non-DNA binding bHLH transcription factor Paclobutrazol Resistances are involved in the regulation of ABA and salt responses in Arabidopsis[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2019，139：239-245.

[29]Verma D，Jalmi S K，Bhagat P K，et al. A bHLH transcription factor，MYC2，imparts salt intolerance by regulating proline biosynthesis in Arabidopsis[J]. FEBS J，2020，287（12）：2560-2576.

[30]Deng C Y，Ye H Y，Fan M，et al. The rice transcription factors OsICE confer enhanced cold tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Signal Behav，2017，12（5）：e1316442.

[31]Yang X Y，Wang R，Hu Q L，et al. DlICE1，a stress-responsive gene from Dimocarpus longan，enhances cold tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Physiol Biochem，2019，142：490-499.

[32]Zhou L，He Y J，Li J，et al. An eggplant SmICE1a gene encoding MYC-type ICE1-like transcription factor enhances freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana[J]. Plant Biol，2020，22（3）：450-458.

[33]Huang X S，Zhang Q，Zhu D，et al. ICE1 of Poncirus trifoliata functions in cold tolerance by modulating polyamine levels through interacting with arginine decarboxylase[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（11）：3259-3274.

[34]Huang X S，Wang W，Zhang Q，et al. A basic helix-loop-helix transcription factor，PtrbHLH，of Poncirus trifoliata confers cold tolerance and modulates peroxidase-mediated scavenging of hydrogen peroxide[J]. Plant Physiol，2013，162（2）：1178-1194.

[35]Geng J J，Wei T L，Wang Y，et al. Overexpression of PtrbHLH，a basic helix-loop-helix transcription factor from Poncirus trifoliata，confers enhanced cold tolerance in pummelo （Citrus grandis） by modulation of H2O2 level via regulating a CAT gene[J]. Tree Physiol，2019，39（12）：2045-2054.

[36]Geng J J，Liu J H. The transcription factor CsbHLH18 of sweet orange functions in modulation of cold tolerance and homeostasis of reactive oxygen species by regulating the antioxidant gene[J]. J Exp Bot，2018，69（10）：2677-2692.

[37]Zhao Q，Xiang X H，Liu D，et al. Tobacco transcription factor NtbHLH123 confers tolerance to cold stress by regulating the ntcbf pathway and reactive oxygen species homeostasis[J]. Front Plant Sci，2018，9：381.

[38]Zhang J，Liu B，Li M S，et al. The bHLH transcription factor bHLH104 interacts with IAA-LEUCINE RESISTANT3 and modulates iron homeostasis in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2015，27（3）：787-805.

[39]Huang D Q，Dai W H. Molecular characterization of the basic helix-loop-helix （bHLH） genes that are differentially expressed and induced by iron deficiency in Populus[J]. Plant Cell Rep，2015，34（7）：1211-1224.

[40]Zhao Q，Ren Y R，Wang Q J，et al. Overexpression of MdbHLH104 gene enhances the tolerance to iron deficiency in apple[J]. Plant Biotechnol J，2016，14（7）：1633-1645.

[41]Li L，Gao W W，Peng Q，et al. Two soybean bHLH factors regulate response to iron deficiency[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2018，60（7）：608-622.

[42]Kobayashi T，Ozu A，Kobayashi S，et al. OsbHLH058 and OsbHLH059 transcription factors positively regulate iron deficiency responses in rice[J]. Plant Molecular Biology，2019，101（4/5）：471-486.

[43]Jiang Y，Yang B，Deyholos M K. Functional characterization of the Arabidopsis bHLH92 transcription factor in abiotic stress[J]. Mol Genet Genomics，2009，282（5）：503-516.

[44]Liu Y，Ji X，Nie X，et al. Arabidopsis AtbHLH112 regulates the expression of genes involved in abiotic stress tolerance by binding to their E-box and GCG-box motifs[J]. New Phytol，2015，207（3）：692-709.

[45]Ji X Y，Nie X G，Liu Y J，et al. A bHLH gene from Tamarix hispida improves abiotic stress tolerance by enhancing osmotic potential and decreasing reactive oxygen species accumulation[J]. Tree Physiol，2016，36（2）：193-207.

[46]Wang F B，Zhu H，Kong W L，et al. The antirrhinum AmDEL gene enhances flavonoids accumulation and salt and drought tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Planta，2016，244（1）：59-73.

[47]Naing A H，Park K I，Ai T N，et al. Overexpression of snapdragon Delila （Del） gene in tobacco enhances anthocyanin accumulation and abiotic stress tolerance[J]. BMC Plant Biol，2017，17（1）：65.

[48]Qiu J R，Xiang X Y，Wang J T，et a. MfPIF1 of resurrection plant yrothamnus flabellifolia plays a positive regulatory role in responding to drought and salinity stresses in Arabidopsis[J]. Int J Mol Sci，2020，21（8）：3011.

[49]Qiu J R，Huang Z，Xiang X Y，et al. MfbHLH38，a Myrothamnus flabellifolia bHLH transcription factor，confers tolerance to drought and salinity stresses in Arabidopsis[J]. BMC Plant Biol，2020，20（1）：542.

[50]Babitha K C，Vemanna R S，Nataraja K N，et al. Overexpression of ecbhlh57 transcription factor from Eleusine coracana L. in tobacco confers tolerance to salt，oxidative and drought stress[J]. PLoS One，2015，10（9）：e0137098.

[51]Li F，Guo S Y，Zhao Y，et al. Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene （OrbHLH001） from Dongxiang Wild Rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell Rep，2010，29（9）：977-986.

[52]Feng H L，Ma N N，Meng X，et al. A novel tomato MYC-type ICE1-like transcription factor，SlICE1a，confers cold，osmotic and salt tolerance in transgenic tobacco[J]. Plant Physiol Biochem，2013，73：309-320.

[53]Zhai Y Q，Zhang L C，Xia C，et al. The wheat transcription factor，TabHLH39，improves tolerance to multiple abiotic stressors in transgenic plants[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2016，473（4）：1321-1327.

[54]Zuo Z F，Kang H G，Hong Q C，et al Y. A novel basic helix-loop-helix transcription factor，ZjICE2 from Zoysia japonica confers abiotic stress tolerance to transgenic plants via activating the DREB/CBF regulon and enhancing ROS scavenging[J]. Plant Mol Biol，2020，102（4/5）：447-462.

[55]Zhang T G，Mo J N，Zhou K，et al. Overexpression of Brassica campestris BcICE1 gene increases abiotic stress tolerance in tobacco[J]. Plant Physiol Biochem，2018，132：515-523.

[56]Chen L，Chen Y，Jiang J F，et al. The constitutive expression of Chrysanthemum dichrum ICE1 in Chrysanthemum grandiflorum improves the level of low temperature，salinity and drought tolerance[J]. Plant Cell Reports，2012，31（9）：1747-1758.

[57]Verma R K，Kumar V V S，Yadav S K，et al. Overexpression of Arabidopsis ICE1 enhances yield and multiple abiotic stress tolerance in indica rice[J]. Plant Signal Behav，2020，15（11）：1814547.

[58]Li Z X，Gao Q，Liu Y Z，et al. Overexpression of transcription factor ZmPTF1 improves low phosphate tolerance of maize by regulating carbon metabolism and root growth[J]. Planta，2011，233（6）：1129-1143.

[59]Li Z X，Liu C，Zhang Y，et al. The bHLH family member ZmPTF1 regulates drought tolerance in maize by promoting root development and abscisic acid synthesis[J]. Journal of Experimental Botany，2019，70（19）：5471-5486.

[60]Yang T R，Yao S F，Hao L，et al. Wheat bHLH-type transcription factor gene TabHLH1 is crucial in mediating osmotic stresses tolerance through modulating largely the ABA-associated pathway[J]. Plant Cell Reports，2016，35（11）：2309-2323.

[61]Yang T R，Hao L，Yao S F，et al. TabHLH1，a bHLH-type transcription factor gene in wheat，improves plant tolerance to Pi and N deprivation via regulation of nutrient transporter gene transcription and ROS homeostasis[J]. Plant Physiol Biochem，2016，104：99-113.