miR-25通過TGF-β1途徑降低缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡

徐敏 岳峰 宋勃 周松 黃晶 田水 劉啟方

(貴州省人民醫院 1康復科，貴州 貴陽 550002；2心內科)

miR-25 在心肌細胞中高表達，參與心肌細胞凋亡和心室重構等病理生理的調節〔1〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是非染色體核蛋白，可導致心肌細胞凋亡及心肌纖維化〔2〕。轉化生長因子(TGF)-β1具有誘導生長能力，在心肌間質細胞、心肌細胞中均有表達，在心肌細胞凋亡發生發展過程中有重要作用〔3,4〕。本課題既往研究證實miR-25靶向調控HMGB1的表達〔5〕，miR-25和HMGB1均具有調控心肌細胞凋亡的作用，但二者調控心肌細胞凋亡與TGF-β1有何種關系，本研究將進行探討。

1 材料和方法

1.1材料 細胞株H9C2心肌細胞來源于胚胎期心臟組織的細胞，購于中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養基、胎牛血清購自Gibco公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液、考馬斯藍染色(Bradford)蛋白濃度測定試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物有限公司；TGF-β、Smad蛋白、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3、HMGB1和B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl)-2抗體購自Gibco公司；SB-431542試劑購于上海嶸崴達實業有限公司。慢病毒載體由上海吉凱公司構建。

1.2方法

1.2.1分組及轉染 H9C2細胞培養24 h 后進行慢病毒感染,向轉染組細胞懸液中加入凝聚胺(polybrene)溶液及慢病毒載體?？瞻讓φ?control) 組未進行轉染;陰性對照(Lv-control) 組轉染Lv-control-miRNA模擬物(mimic)；Lv-anti-control組轉染Lv-control-miRNA-抑制劑(inhibitor);Lv-miR-25組轉染Lv-miR-25 mimic；Lv-anti-miR-25組轉染Lv-miR-25 inhibitor。按照脂質體轉染試劑Lipofectamine2000 試劑盒說明，Contol-shRNA組轉染control-shRNA；HMGB1-shRNA組轉染HMGB1-shRNA，經培養后篩出穩定細胞系。選取高表達miR-25 H9C2心肌細胞，Lv-miR-25組轉染Lv-miR-25 mimic，Lv-miR-25+SB431542組轉染Lv-miR-25 mimic后加入TGF-β1/smads抑制劑SB431542共培養。穩定轉染后予缺氧/復氧處理，缺氧培養箱(37℃、1% O2、5% CO2、94% N2)培養24 h后行復氧培養箱(95%空氣和5% CO2)1 h〔6〕。

1.2.2Western印跡檢測蛋白表達 Western 印跡法檢測HMGB1、Bcl-2、Cleaved caspase-3、TGF-β1、Smad3、磷酸化(p)-Samd3、細胞外信號調節激酶(ERK)1/2、p-ERK1/2蛋白表達。RIPA裂解液提取細胞總蛋白，蛋白定量后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，電轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉及洗膜后，均加入按照1∶1 000稀釋好的cleaved caspase-3、Bcl-2、HMGB1、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、ERK1/2、p-ERK1/2抗體，4℃搖床孵育24 h，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，電化學發光(ECL)顯色。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 收集缺氧/復氧處理的細胞，制備成105/ml 濃度的細胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，離心棄上清重懸細胞，加入膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)5 μl和碘化丙啶(PI)10 μl，室溫孵育15 min，上流式細胞儀分析。

1.3統計學方法 應用SPSS20.0軟件進行數據分析。Bonferroni法進行組間均數的兩兩比較，多組數據的比較采用方差分析。

2 結 果

2.1miR-25調控HMGB1及細胞凋亡相關蛋白的表達 Lv-miR-25組HMGB1、Cleaved caspase-3蛋白表達水平明顯低于Control組、Lv-control組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于Control組、Lv-control組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組(均P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 各組H9C2細胞中HMGB1、Bcl-2和Cleaved caspase-3 蛋白表達比較

2.2HMGB1調控TGF-β1、Smad蛋白及細胞凋亡相關蛋白的表達 與Contol-shRNA組相比，HMGB1-shRNA 組HMGB1、TGF-β1蛋白、p-Smad3、Cleaved caspase-3蛋白表達顯著下降、Bcl-2蛋白表達顯著上升(P<0.05)。兩組ERK1/2蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

1～5：Control組、Lv-control組、Lv-miR-25組、Lv-anti-control組、Lv-anti-miR-25組；圖2同圖1 miR-25高表達對H9C2心肌細胞 HMGB1表達的影響

圖2 miR-25高表達對H9C2心肌細胞凋亡 相關蛋白表達的影響

圖3 沉默HMGB1表達對H9C2心肌細胞 TGF-β1表達的影響

圖4 沉默HMGB1表達對H9C2心肌細胞凋亡 相關蛋白表達的影響

表2 各組H9C2細胞中HMGB1、Bcl-2和Cleaved caspase-3蛋白表達比較

2.3TGF-β1/Smads信號通路調控細胞凋亡 相對于Lv-miR-25組，Lv-miR-25+SB431542組Cleaved caspase-3表達顯著增加，Bcl-2蛋白表達顯著下降(均P<0.05)，提示細胞凋亡減少。相對于Lv-miR-25組，Lv-miR-25+SB431542組凋亡細胞明顯減少(16.17%±3.06% vs 6.13%±1.26%P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 TGF-β1抑制劑對H9c2心肌細胞凋亡相關蛋白表達及凋亡率的影響

表3 各組H9C2細胞中Bcl-2和Cleaved caspase-3 蛋白表達比較

3 討 論

細胞凋亡是一個復雜的病理生理過程，涉及多種亞細胞器和細胞分子。研究表明缺血缺氧和再灌注損傷引起的細胞凋亡是通過線粒體途徑完成的，Bcl-2家族、caspase家族在細胞凋亡過程中均發揮重要作用。Bcl-2 的表達下調，caspase-3表達上調，引起心肌細胞凋亡；Bcl-2表達上調及caspase-3表達下調對心肌細胞凋亡起抑制作用〔7〕。本研究通過高表達miR-25，檢測凋亡相關蛋白表達，結果顯示Bcl-2表達上調及caspase-3表達下調，對心肌細胞凋亡具有保護作用。HMGB1 在心血管疾病發生發展的過程中發揮重要的作用。Foglio等〔8〕研究在心肌梗死大鼠模型試驗中，給予HMGB1治療，能夠降低caspase-3表達，減輕心肌細胞凋亡率。Hu等〔9〕報道HMGB1在心肌缺血再灌注損傷中扮演著重要的作用，能夠導致心肌細胞凋亡，給予HMGB1抗體處理，能夠顯著增加Bcl-2蛋白表達及較少的凋亡細胞，其作用通過調控白細胞介素-17A。本研究發現通過轉染shRNA-HMGB1抑制H9C2細胞HMGB1的表達，檢測凋亡相關蛋白表達，Bcl-2表達上調及caspase-3表達下調，心肌細胞凋亡減少。檢測TGFβ1、p-Smad蛋白表達下降，HMGB1的表達下降具有下調TGF-β1、p-Smad蛋白的作用。TGF-β1 是一種的具有眾多功能的細胞因子，TGF-β1 及受體在心肌間質細胞、心肌細胞中均有表達，它通過調控特殊的信號通路誘導心肌細胞的凋亡〔10，11〕。Wua等〔12〕研究顯示，miR-202-3p通過負向調控TRPM6的表達，抑制TGF-β1/smads信號通路減少缺血再灌注損傷所致的心肌細胞凋亡。本研究通過使用TGF-β1抑制劑SB431542與高表達miR-25 H9C2細胞共培養，結果顯示相對于單純高表達miR-25細胞組，使用TGF-β1抑制劑SB431542能夠進一步抑制心肌細胞凋亡。由此推斷下調TGFβ1表達能夠降低心肌細胞凋亡。miR-25具有靶向調控HMGB1的作用。本研究證實HMGB1的表達下降能夠下調TGF-β1蛋白的表達，TGF-β1具有調控細胞凋亡的作用，因此得出miR-25通過HMGB1影響TGF-β1/smads信號通路參與保護心肌細胞凋亡的作用。但心肌缺血再灌注損傷導致細胞凋亡是眾多因素共同作用的復雜過程，各種細胞因子之間錯綜復雜的調控關系及轉錄后的基因調控都扮演著重要的作用，本研究僅僅探討心肌細胞凋亡調控的一種途徑。