類風濕關節炎患者血清DKK-1，CCL21水平與體液免疫指標的相關性研究

劉素芳，趙 陽，賈 彬，李俊芳（邯鄲市中心醫院免疫科，河北邯鄲 056001）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，影響全球約1%的人口[1]，以滑膜炎、血管翳形成、關節軟骨和骨破壞為主要病理表現，可導致慢性疼痛和功能障礙[2]?，F有研究顯示RA患者普遍存在體液免疫功能異常，體液免疫紊亂是RA發病的主要原因和關鍵環節[3]。Dickkopf-1（DKK-1）是內源性Wnt信號通路拮抗劑，可抑制成骨細胞分化，促使破骨細胞生成，導致骨量流失[4]，參與類風濕關節炎發病過程[5]。趨化因子（chemokine, CCL）21是趨化因子家族成員，可介導細胞間黏附和白細胞遷徙，誘導免疫和炎癥損傷，現有研究結果表明RA患者外周血CCL21水平均增高[6]，提示CCL21參與RA發病。本研究通過檢測RA患者血清DKK-1，CCL21水平以及免疫球蛋白（immunoglobulin ，Ig）、補體含量，探討其間關系，旨在為臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究獲得邯鄲市中心醫院免疫科倫理委員會批準，選擇2018年3月～2020年6月邯鄲市中心醫院免疫科收治的120例RA患者，納入標準：①符合RA診斷和分類標準[7]；②本研究所需實驗室檢測項目結果完整；③年齡＞18周歲。排除標準：①強直性脊柱炎、骨關節炎、痛風、骨腫瘤；②并發其它部位惡性腫瘤、心腦血管疾??；③并發哮喘、過敏性鼻炎、自身免疫性肝病等其它自身免疫性疾病。根據28個關節疾病活動度（DAS28）評分分為低度組（2.6～3.2分，38例），中度組（3.3～5.1分，50例）和重度組（＞5.1分，32例）[7]。低度組：女性25例，男性13例，年齡41～69（56.35±10.26）歲，RA病程3～9（6.65±1.81）年；中度組：女性35例，男性15例，年齡36～71（56.60±10.19）歲，RA病程5～12（7.98±2.21）年；重度組：女性22例，男性10例，年齡39～70（56.12±10.02）歲，RA病程8～19（10.65±3.81）年。另選擇同期我院門診體檢的117例健康志愿者為對照組，均排除骨創傷、骨關節炎以及風濕和類風濕疾病，女性75例，男性42例，年齡42～78（56.85±10.41）歲。四組受試者均知情同意并簽署同意書，年齡、性別比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑 意大利BIOBASE2000全自動酶免分析儀，CCL21試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號2633JK）；DKK-1試劑盒（北京榮志海達生物科技有限公司，批號180513）；IgA，IgG，IgM，IgE，補體C3，補體C4試劑盒（美國Epitope Diagnostics公司，試劑盒批號AM1805）。

1.3 方法 所有受試者均采集靜脈血3ml注入干燥試管（RA患者入院第2天，體檢者體檢當日），血液自然凝固后離心（轉速3 000r/min，半徑15cm，時間5min），留取血清備用。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血漿DKK-1，CCL21水平；免疫透射比濁法檢測血清IgA， IgG， IgM， IgE，補體C3和補體C4。

1.4 統計學分析 采用SPSS 25.00進行數據分析，K-S法檢驗計量資料擬合優度，連續性變量以均數±標準差（±s）表示，性別以例表示，分別采用單因素方差分析（兩兩對比采用LSD-t檢驗），χ2檢驗。Pearson相關系數描述DKK-1，CCL21與IgG，IgA，IgM，IgE，補體C3，補體C4之間相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 血清DKK-1，CCL21水平比較 見表1。RA組血清DKK-1，CCL21水平高于對照組（t=18.435，32.803，P＜0.05）。重度組血清DKK-1，CCL21水平高于中度組和輕度組（t=6.709，8.461；37.111,40.935，均P＜0.05），中度組血清DKK-1，CCL21水平高于輕度組（t=14.058,14.933，均P＜0.05），差異均有統計學意義。

表1 各組血清DKK-1，CCL21水平比較(±s，pg/ml)

表1 各組血清DKK-1，CCL21水平比較(±s，pg/ml)

項目 RA組（n=120）輕度組（n=138）中度組（n=150）重度組（n=132）對照組（n=117） F值 P值DKK-1 72.14±15.26 59.15±2.34 74.90±6.59 83.26±3.09 43.26±7.46 105.665 0.000 CCL21 285.16±32.16 258.15±4.06 289.75±12.54 310.06±6.45 170.06±20.41 96.351 0.000

2.2 免疫球蛋白和補體比較 見表2。RA患者血清IgG，IgA，IgM水平高于對照組（t=13.402，30.852，10.061，均P＜0.05），補體C3，補體C4水平低于對照組（t= 12.502，17.579，均P＜0.05）,IgE與對照組比較差異無統計學意義（t=0.148，P＞0.05）。重度組血清IgG，IgA，IgM水平高于中度組和輕度組（t=9.296, 6.322, 8.451；162.999,67.177, 64.106，均P＜0.05），補體C3，補體C4水平低于中度組和輕度組（t=11.206, 5.536；44.909,45.847，均P＜0.05），中度組血清IgG，IgA，IgM水平高于輕度組（t=15.608, 12.993, 17.468，均P＜0.05），補體C3，補體C4水平低于輕度組（t=18.607,10.527，均P＜0.05），差異均有統計學意義。

表2 各組免疫球蛋白和補體水平比較（±s）

表2 各組免疫球蛋白和補體水平比較（±s）

項目 RA組（n=120）輕度組（n=38）中度組（n=50）重度組（n=32）對照組（n=117） F值 P值IgA（g/L） 3.65±0.52 3.16±0.02 3.71±0.26 4.14±0.03 2.02±0.24 53.261 0.000 IgM（g/L） 1.95±0.42 1.57±0.03 2.03±0.16 2.28±0.06 1.42±0.39 69.652 0.000 IgG（g/L） 16.35±4.56 12.03±0.21 17.40±2.11 19.84±0.68 10.35±1.65 42.135 0.000 IgE（mg/L） 163.68±23.67 163.26±22.11 163.32±21.43 164.74±20.40 163.23±23.15 0.869 0.000補體C3（g/L） 1.05±0.16 0.91±0.02 1.07±0.05 1.18±0.02 1.39±0.25 46.351 0.000補體C4（g/L） 0.15±0.07 0.09±0.01 0.16±0.04 0.20±0.01 0.36±0.11 68.195 0.000

2.3 DKK-1，CCL21與體液指標的相關性 見表3。RA患者血清DKK-1，CCL21水平與IgG，IgA，IgM呈正相關（P＜0.05），與補體C3，補體C4水平呈負相關（P＜0.05），與IgE無相關性（P＞0.05）。

表3 DKK-1，CCL21與體液指標的相關性（r，P）

3 討論

體液免疫是人體免疫系統的主要分支，主要通過漿細胞產生抗體發揮免疫保護作用機制，體液免疫紊亂是 RA發病的重要環節之一，致病因子侵入人體后，B細胞活化分泌大量抗體，抗體與抗原結合形成免疫復合物沉積于關節引起一系列免疫反應，引起組織損傷、滑膜增生及嚴重的破壞性關節炎[8]。B淋巴細胞是細胞共刺激分子，可通過促使機體產生針對自身抗原的抗體，引起多種免疫球蛋白升高[9]，還可激活補體系統，并引起補體成分的消耗[10]?，F有研究顯示免疫球蛋白升高的幅度與RA疾病的病程和嚴重程度有關[3]。

本研究結果表明RA患者血清DKK-1水平高于對照組，且DKK-1水平與RA疾病活動度有關，DKK-1是一種分泌型糖蛋白，由成熟成骨細胞和骨細胞分泌，DKK-1通過與受體LRP5/6結合阻斷Wnt/β-catenin信號在細胞內傳遞，具有調節細胞增殖、分化、遷移、胚胎發育、器官發生和體內平衡等多種生物學功能[11]。DKK-1表達異常與多種疾病的發病和進展有關，包括惡性腫瘤發病、侵襲、轉移[12]、動脈粥樣硬化性腦血管疾病[13]、脊椎關節病[14]和類風濕關節炎[5]。DKK-1 作為Wnt/β-catenin通路的關鍵調控因子，通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路，破壞成骨-破骨系統穩定性，促使成骨細胞生成減少，破骨細胞生成增多，加速骨細胞凋亡和壞死進程[15]，由此可見DKK-1參與了RA骨侵蝕這一重要過程。但是DKK-1是否與RA體液免疫異常有關尚不得知，本研究發現RA患者血清IgG，IgA，IgM水平增高，補體C3，C4水平降低，DKK-1與IgG，IgA，IgM水平呈正相關，與補體C3，C4水平呈負相關，說明DKK-1參與RA體液免疫調節過程，DKK-1含量增加可能導致了免疫球蛋白增加，補體消耗?，F有研究顯示外周循環血中DKK-1主要來源于血小板，DKK-1含量增加可通過p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和蛋白激酶1（SGK-1）激活輔助性T細胞2（Th2）及其細胞因子的產生，進而調節免疫炎性反應[16]。DKK-1在調節性T細胞（Treg）中也有豐富的表達，參與自身免疫性結腸炎的免疫耐受過程，有趣的是DKK-1在這一過程中受有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑調控，不受經典的Wnt/β-catenin途徑調控[17]。眾所周知，在免疫反應中，T細胞可釋放淋巴因子刺激B細胞，B細胞作出免疫應答分化為漿細胞和記憶B細胞，介導產生抗體，發揮體液免疫作用，由此可見DKK-1可能間接參與體液免疫調節過程。

本研究結果表明RA患者血清CCL21水平明顯增高，且CCL21水平隨著RA活動度的增加而升高，說明CCL21參與RA發病和進展。CCL21定位于染色體 9p13，也稱 TCA-4和 6Ckine，其受體是CCR7，CCR7在樹突狀細胞、胸腺細胞、B細胞和T細胞中表達，調控免疫細胞歸巢，既維持適應性免疫系統的穩態，還可引起慢性炎性疾病[18]。CCL21與細胞膜表面上的受體CCR7結合，激活JNK 和p38MAPK等多種信號通路調節細胞生長、分化、凋亡和遷移過程，介導炎癥反應和免疫損傷等病理過程[19]?，F有研究顯示CCL21/ CCR7軸不僅參與惡性腫瘤上皮間質轉化、侵襲轉移過程[20]，還參與軟骨修復愈合過程[21]以及RA關節炎癥和骨侵蝕過程[22]。本研究進一步相關分析發現CCL21與體液指標均存在相關性，說明CCL21具有調節RA體液免疫的作用。CCL21可通過活化T細胞，募集T細胞、B細胞、單核細胞和巨噬細胞誘導關節炎癥和骨侵蝕，并通過PI3K，ERK和JNK信號通路調節血管內皮生長因子表達，促使新生血管和血管翳形成，進而損傷骨關節，導致嚴重的疼痛、僵硬和活動障礙[23]。CCL21通過誘導M1細胞因子將幼稚T細胞分化為輔助性T細胞17（Th17），加速RA患者破骨細胞生成[24]。由此推測CCL21可能通過調控T細胞分化和細胞免疫功能，影響RA患者體液免疫系統。GPR174參與B細胞分化和活化，CCL21是GPR174的趨化受體，GPR174/ CCL21可正向調控B細胞遷移，誘導體液免疫[25]，可見CCL21可能通過GPR174/ CCL21途徑直接影響RA患者體液免疫過程。

綜上，RA患者血清DKK-1，CCL21水平均增高，DKK-1，CCL21水平與RA疾病活動度有關，DKK-1，CCL21可能直接或間接參與了RA患者體液免疫調控過程。本研究局限性在于尚不能直接證明DKK-1，CCL21在RA體液免疫調節的作用，其機制尚需進一步開展基礎研究證實。