潮汐運行方式對人工濕地處理含鹽廢水脫氮性能的影響?

張曉雨， 王福浩， 夏振剛， 佘宗蓮??

(1. 中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室， 山東 青島 266100； 2. 青島水務環境公司， 山東 青島 266021)

迄今為止，針對垂直流人工濕地處理含鹽廢水的研究主要集中在傳統垂直流人工濕地和復合垂直流人工濕地，利用TFCW處理含鹽廢水的研究較少，尤其是關于高鹽條件下F/R對TFCW脫氮性能的影響尚未見報道。本研究利用TFCW處理含鹽廢水，探究了不同F/R條件下的污染物去除效率，確定了實現高效脫氮的F/R，結合濕地內無機氮的沿程分布特征和微生物群落結構的時空變化，闡析了無機氮的去除途徑。

1 材料與方法

1.1 人工濕地的結構和運行模式

本研究采用實驗室規模的潮汐流人工濕地，露天放置在中國海洋大學校園內(山東省青島市)，實驗裝置如圖1所示。實驗時期為春、夏和秋3個季節，總計185 d。實驗期間進水溫度范圍為12～28 ℃。

圖1 潮汐流人工濕地實驗裝置圖Fig.1 Schematic diagram of a TFCW system

人工濕地直徑為0.3 m、高1.0 m，填料高度為0.78 m。填料從上到下依次為：5 cm粗砂層(粒徑1～4 mm)、30 cm爐渣層(粒徑2～10 mm)、28 cm細礫石層(粒徑5～20 mm)和15 cm粗礫石(粒徑50～100 mm)。沿濕地深度設置4個水樣取樣口，距基質表面深度(即沿程深度)分別為27、43、59和76 cm，其中76 cm取樣口與電磁閥連接，通過繼電器控制電磁閥定時排水。此外，沿濕地深度設置4個基質取樣口，距基質表面深度分別為0～5 cm、18～23 cm、38～43 cm和58～63 cm(編號為S1、S2、S3和S4)。濕地表面栽種2株鹽地堿蓬(Suaedasalsa(L.) Pall.)，幼株采自李村河，為一年生草本植物，多生長在鹽堿地、海灘和湖邊，具有較好的耐鹽性。

廢水由蠕動泵送入表面的布水系統，均勻噴撒在濕地表面，向下流動進入濕地內；濕地進水流速為230 mL·min-1，平均表面負荷為0.33 m3·(m2·d)-1。實驗分4個階段，各階段運行條件如表1所示。階段1、2和3運行過程中，濕地1次潮汐(即1個周期)歷時均為24 h，但3個階段的F/R不同，以比較F/R對濕地內污染物去除效果的影響，這3個階段進水結束后濕地內填料處于完全淹沒狀態。階段4在24 h內總淹沒時間和總空閑時間與階段3相同，且24 h內處理的水量與前3個階段相同，但階段4實驗期間24 h經歷2次潮汐(即1次潮汐歷時12 h)，且階段4進水結束后淹沒期濕地處于半淹沒狀態(水位距濕地表面為43 cm，即淹沒階段濕地分為上部不飽和區和下部飽和區)，以對比分析潮汐頻次和淹沒深度對濕地性能的影響。

1.2 進水水質

1.3 水質測定和分析方法

每個階段運行達到穩定時，在1個周期內每隔1 h從4個水樣取樣口采集水樣，測定污染物濃度和環境參數，重復取樣3次(1次/d)。

表1 濕地運行參數Table 1 Operational parameters of wetland

(1)

使用IBM SPSS Statistics 23軟件對各階段的實驗數據進行統計分析，采用單因素方差分析法(ANOVA,Analysis of variance)檢驗不同階段污染物去除效果的差異性，當p<0.05 時，認為組間具有顯著性差異。

1.4 微生物群落結構分析

實驗結束時，從4個基質取樣點采集填料樣品，稱取20～60 g置于三角瓶中，加入40 mL PBS緩沖液，超聲振蕩30 min后置于搖床中常溫震蕩3 h(220 r/min)，使填料上的生物膜脫落并破碎，震蕩后的混合液用滅菌紗布過濾以除掉填料等雜質，濾液為含有生物膜的混濁液，濾液置于50 mL離心管中在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，底部沉淀物即為提取的生物膜。使用Powerful Soil DNA試劑盒(MoBio Laboratories，USA)提取生物膜中的DNA，將提取的DNA采用引物515F(5′-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′)通過聚合鏈式反應(PCR)擴增16S rDNA的V4-V5高變區，擴增產物提交給專業測序公司Novogene(中國北京)，在Illumina MiSeq平臺進行高通量測序，測序原始數據在經質量過濾、去除嵌合體等質控步驟后，以相似度97%對所有序列進行OTU劃分，并利用SILVA、RDP classifier等數據庫進行物種注釋，運用QIIME等軟件進行包括Alpha多樣性、Beta多樣性在內的指數進行多樣品比較分析。

2 結果與討論

2.1 淹沒/空閑時長比對污染物去除效果的影響

各階段濕地運行達到穩定時，進出水環境參數見表2。

表2 進出水環境參數(平均值±標準差)Table 2 Average values of environmental parameters of influent and effluent (mean ± SD)

F/R為13.2 h/8.8 h和14.5 h/7.5 h時，出水水溫均高于進水水溫，可能是階段1和階段2的實驗穩定期為夏季(6—8月)，較長時間的太陽照射提高了濕地內水溫。各階段出水DO 含量均明顯低于進水(p<0.05)，這是因為濕地處于淹沒狀態時好氧微生物氧化有機物和氮的過程會消耗水中溶解氧，導致出水DO水平下降。淹沒時間較長的階段2和階段3的出水DO濃度低于淹沒時間較短的階段1，說明淹沒時間增加會導致濕地內DO水平下降；此外，階段4的出水DO濃度高于階段3，說明總淹沒時間相同時增加潮汐流頻次有利于濕地復氧。

階段1、2和4 條件下出水 pH 均低于進水，這與階段1、2中淹沒反應時間較短、反硝化釋放的堿度較少有關；階段4經歷2次潮汐流，強化了濕地復氧，更有利于硝化作用和有機物氧化，但弱化了反硝化作用和堿度的釋放。對于階段1、2和3來講，出水pH隨F/R增大和濕地淹沒時間增加而升高，階段3時F/R最大、出水pH最高，且略高于進水，這可以從階段3淹沒時間較長、反硝化反應較充分、產生堿度較多來解釋。

圖2 F/R對污染物去除的影響Fig. 2 The effect of F/R on the pollutant removal efficiency

各F/R條件下達到穩定狀態時，COD去除效果均較好，F/R為13.2 h/8.8 h時，COD去除率高達98.17%，F/R增加至14.5 h/7.5 h和15.5 h/6.5 h后，COD去除率分別降至88.72%和91.96%，說明延長淹沒時間、減少空閑時間會導致有機物去除效率下降，這是因為隨淹沒時間的增加使濕地內DO含量降低(如表2所示)，導致有機物氧化效能降低。F/R為7.75 h/3.25 h條件下，COD去除率(93.10%)比F/R為15.5 h/6.5 h階段略高，這可歸因于前者比后者多了1次潮汐流，促進了濕地復氧，從而有利于有機物的氧化分解。表2中顯示的階段4出水DO濃度高于階段3的結果可以支持這種解釋。

2.2 淹沒期氮沿程分布

((a)～(d)分別為F/R (h/h)=13.2/8.8、14.5/7.5、15.5/6.5和7.75/3.25。 (a)～(d) represent the F/R (h/h)=13.2/8.8、14.5/7.5、15.5/6.5 and 7.75/3.25, respectively.)

((a)～(d)分別為F/R (h/h)=13.2/8.8、14.5/7.5、15.5/6.5和7.75/3.25). (a)～(d) represent the F/R (h/h)=13.2/8.8、14.5/7.5、15.5/6.5 and 7.75/3.25, respectively.)

2.3 微生物群落的豐富度和多樣性

實驗結束時取不同深度填料樣品，采用高通量測序技術分析了濕地內不同深度細菌和古菌群落的豐富度和多樣性，結果見表3。通過對相似度為97%以上的序列進行聚類分析，得到3 473個OTUs。所有樣品的測序覆蓋率均超過99%，說明測序的結果涵蓋了絕大部分的物種，能夠有效地反映微生物的豐富度和多樣性[20]。微生物豐富度由Chao1和ACE指數表示，濕地內細菌和古菌的豐富度均隨深度增加而明顯提高，較深的爐渣層和礫石層中微生物的豐富度較頂部的粗砂層更高，可能是由于爐渣的多孔結構和礫石粗糙的表面結構為微生物提供了適宜的生存環境，有利于微生物富集[17]。微生物多樣性由Shannon和Simpson指數表示，隨深度增加細菌多樣性呈現先升高后降低的趨勢，在18～23 cm深度達到最高；隨深度增加古菌多樣性呈現先降低后升高的趨勢，在0～5 cm表層最高。另外，濕地各層中細菌的豐富度和多樣性均高于古菌，這可能由于細菌更容易在充氧條件良好的濕地系統中富集，在Pelissari等[21]利用垂直流人工濕地進行生物脫氮的研究中也有類似的報道。

2.4 微生物在門水平的群落結構

相對豐度最高的古菌門為奇古菌(Thaumarchaeota，37.20%～81.80%)，是人工濕地好氧/缺氧環境中常見的氨氧化古菌[27-28]，曾有報道在垂直流人工濕地中擁有很高的豐度(57.00%)[29]。本研究濕地中檢測出高豐度的奇古菌，說明該菌門在潮汐流人工濕地脫氮過程中發揮了重要作用。

表3 濕地內微生物群落豐富度和多樣性Table 3 Diversity and richness of the microbial community in wetland

表4 古菌群落在門水平的分布Table 4 Microbial composition of archaea at phylum level %

圖5 細菌群落在門水平的分布Fig. 5 Microbial composition of bacteria at phylum level

2. 5 微生物在屬水平的群落結構

濕地內不同深度微生物群落在屬水平的分布見圖6。不同深度處細菌優勢菌屬差異較大，0～5 cm、18～23 cm、38～43 cm和58～63 cm深度的優勢菌屬分別為植物內生中村氏菌(Nakamurella，6.20%)和獨島桿菌(Dokdonella，6.00%)、冷單胞菌(Psychromonas，8.20%)和植物內生中村氏菌(5.00%)、冷單胞菌(10.30%)和植物內生中村氏菌(5.10%)、冷單胞菌(15.70%)和海洋白紅細菌(Albirhodobacter，9.40%)。冷單胞菌除在表層(0～5 cm)中相對豐度較低(0.30%)外，在其他深度均為優勢菌屬，且相對豐度隨深度增加而增加(從0.30%增加到15.7%)；冷單胞菌為嗜鹽菌，在濕地下部飽和區污水與填料接觸時間較長，因而更有利于嗜鹽的冷單胞菌屬富集；冷單胞菌具有降解有機物的功能[30]，且能促進生物膜的形成[31]。據報道，在處理非含鹽廢水的TFCW中沒有檢測到冷單胞菌[32]。

圖6 微生物群落在屬水平的分布Fig. 6 Microbial distribution of microbial at genus level

本研究檢測到的反硝化菌屬(DNB)大部分屬于變形菌門，其中相對豐度較高的為獨島桿菌(Dokdonella，1.40%～6.00%)和植物內生中村氏菌(Nakamurella，1.30%～6.20%)，兩個菌屬的相對豐度均隨濕地深度的增加而降低，0～5 cm深度處相對豐度分別為6.00%和6.20%，在58～63 cm深度處相對豐度降低至1.70%和1.30%。獨島桿菌和植物內生中村氏菌均為異養反硝化菌[36-37]，本研究濕地內COD濃度隨深度增加明顯降低(見圖4)，即隨深度增加異養反硝化所需的碳源減少，這不利于濕地深處異養反硝化菌的生長繁殖，因而使獨島桿菌和植物內生中村氏菌的相對豐度隨深度增加而降低。

本研究濕地中只檢測到1個相對豐度大于0.5%古菌屬Candidatus_Nitrosoarchaeum，屬于奇古菌門，是一種具有氨氧化功能的古菌[25,32]。Candidatus_Nitrosoarchaeum在各深度處的相對豐度均很高，在0～5 cm、18～23 cm、38～43 cm和58～63 cm深度的豐度分別為33.90%、78.00%、72.50%和44.50%，可知Candidatus_Nitrosoarchaeum屬是本研究濕地中重要的氨氧化古菌，在濕地脫氮過程中發揮了重要作用，這與前人的研究結果一致[38-39]。此外，比較而言，Candidatus_Nitrosoarchaeum在表層和底部的豐度較低(分別為33.90%和44.50%)，在中部的豐度較高(72.50%～78.00%)，說明濕地中部好氧/缺氧的兼性環境更有利于其生長繁殖，這與Bouali等[38]的研究結果類似。

3 結論

(2)濕地內不同深度處微生物群落結構存在明顯差異，表層細菌的豐富度和多樣性均明顯低于深層；表層古菌的豐富度低于深層，而表層古菌的多樣性明顯高于深層；濕地內各深度處細菌的豐富度和多樣性均明顯大于古菌。

(3)濕地內檢測到的優勢細菌門是變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、放線菌(Actinobacteria)、綠彎菌(Chloroflexi)、酸桿菌(Acidobacteria)和浮霉菌 (Planctomycetes)；優勢細菌屬為植物內生中村氏菌(Nakamurella)、獨島桿菌(Dokdonella)、冷單胞菌(Psychromonas)和海洋白紅細菌(Albirhodobacter)。相對豐度最高的古菌門是奇古菌(Thaumarchaeota)，優勢古菌屬是Candidatus_Nitrosoarchaeum。

(4)濕地中檢測到的氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌是亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)和硝化螺旋菌(Nitrospira)，主要反硝化細菌是獨島桿菌(Dokdonella)和植物內生中村氏菌(Nakamurella)。氨氧化細菌和亞硝酸鹽氧化細菌在濕地中下部豐度較高，反硝化細菌在濕地中上部豐度較高；硝化細菌的豐度遠低于反硝化細菌。