血管生成擬態在翼狀胬肉進展中的作用及可能機制

賀夢璇 唐秋陽 張俊芳 楊 鈴 秦 柏 顧宏衛 管懷進 石海紅

翼狀胬肉是常見的眼表疾病之一，臨床上表現為瞼裂區呈翼狀的纖維血管組織增生侵入角膜，常影響美觀，可導致干眼、角膜散光[1]、視力下降，若增生組織遮蓋視軸則會嚴重影響患者的生活質量。翼狀胬肉具有許多腫瘤樣特性，包括輕度發育不良、局部浸潤、術后易復發、微衛星不穩定性及雜合性丟失[2]等，故部分學者認為其是一種腫瘤樣病變。血管生成擬態(VM)是最新發現的腫瘤微循環模式，它是由高度侵襲性的腫瘤細胞通過自身變形及細胞外基質重塑形成，管腔無內皮細胞襯覆，且可與宿主血管相連通使腫瘤獲得血液供應[3-4]。有研究發現，VM也存在于翼狀胬肉組織中，參與翼狀胬肉的血液供應[5]。本研究通過統計不同類型翼狀胬肉中VM的陽性率并對比VM陽性組和VM陰性組患者的翼狀胬肉臨床病理特征及相關分子的表達，進一步探討VM與翼狀胬肉進展的相關性及其形成的可能機制。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本獲取選取2019年1月至2020年1月于南通大學附屬醫院眼科行翼狀胬肉切除手術的初發型翼狀胬肉標本125例，以及2017年1月至2020年12月于本院行同一手術的復發型翼狀胬肉標本54例，另選取10例于本院捐獻眼球的正常結膜組織作為對照。收集患者的性別、年齡、病程等一般資料。所有翼狀胬肉患者病灶均位于鼻側，且排除其他眼表疾病及眼部外傷史、手術史或長期用藥史，手術均由同一醫生完成，所取標本均為完整的翼狀胬肉組織。對照組受試者均無眼表疾病，無眼部外傷史、手術史或長期用藥史。本研究遵循《赫爾辛基宣言》原則，通過南通大學附屬醫院倫理委員會審查批準，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器蘇木精-伊紅染色試劑、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋有限公司)，GTVisionTMIII抗鼠/抗兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?，CD31抗體、VEGF抗體(英國Abcam公司)，基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)抗體(美國GeneTex公司)，檸檬酸鈉抗原修復液、過碘酸-雪夫染色試劑盒、蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、抗體稀釋液及增強化學發光反應檢測試劑盒(北京索萊寶有限公司)。DM3000光學顯微鏡及顯微攝像系統(德國Leica公司)。

1.2 方法將術中取下的正常結膜及翼狀胬肉組織每份均取一半凍存用于Western blot檢測，另一半使用40 g·L-1多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋，制成厚度約為4 μm的切片，用于病理學觀察。

1.2.1 翼狀胬肉分組標準靜止期翼狀胬肉：頭部扁平，角膜浸潤不明顯或無浸潤，頸部及體部菲薄，不充血，血管纖細，表面光滑；進展期翼狀胬肉：胬肉頭部隆起，不同程度的角膜浸潤，頸部及體部肥厚，血管較正常結膜組織充血、擴張，表面不光滑。初發型翼狀胬肉：初次形成的翼狀胬肉；復發型翼狀胬肉：手術切除后，再次形成的翼狀胬肉。

1.2.2 CD31/PAS雙重染色切片脫蠟至水，65 ℃烘箱中干燥40 min，PBST(含0.5 g·L-1Triton-100的PBS溶液)漂洗，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復15～20 min，PBST漂洗，體積分數3%H2O2消除內源性過氧化物酶活性20 min(避光)，PBST漂洗，體積分數10%山羊血清封閉40 min，不洗，加入CD31(150)一抗，4 ℃孵育過夜。復溫，PBST漂洗，滴加HRP標記聚合物37 ℃孵育30 min，PBST漂洗，DAB顯色，蒸餾水浸洗，高碘酸氧化5 min，蒸餾水浸洗，Schiff液避光染色10 min，蒸餾水浸洗，蘇木素染核5 min，稀鹽酸酒精分化2～5 s，自來水漂洗，蒸餾水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，自然干燥后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 HE染色以臨床上最常見的初發型進展期翼狀胬肉為研究對象，將VM陽性者作為VM陽性組，VM陰性者作為VM陰性組，隨機選取20例VM陽性組及20例VM陰性組的翼狀胬肉標本進行HE染色。將切片置于65 ℃烘箱中干燥40 min，PBS漂洗，蘇木素染色5 min，PBS漂洗，稀鹽酸酒精分化，自來水漂洗，蒸餾水返藍，伊紅染液染色5 min，洗去浮色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 免疫組織化學染色對1.2.3中各切片進行免疫組織化學染色?？乖迯?，消除內源性過氧化物酶活性，封閉，孵育一抗(MMP-2稀釋度為 1400；MMP-9稀釋度為1100；VEGF稀釋度為1100)，孵育二抗，DAB顯色，蘇木素染核，分化，返藍，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。隨機選擇5個高倍視野，以鏡下顏色強度及陽性細胞百分比予以評分。無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。陽性細胞百分比：0%～5%計為0分，>5%～25%計為1分，>25%～50%計為2分，>50%～75%計為3分，>75%計為4分。兩項得分相乘，0分計為 “-”，1～4分計為 “+”，5～8分計為 “++”，9～12分計為 “+++”。

1.2.5 Western blot檢測在初發型進展期翼狀胬肉標本中，隨機選取VM陽性組、VM陰性組各3例凍存標本，利用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，制備100 g·L-1SDS-PAGE凝膠，每孔加入20 μg蛋白樣品，常規電泳、轉膜、封閉，隨后分別加入兔抗人MMP-2抗體(稀釋度為1500)、兔抗人MMP-9抗體(稀釋度為1500)、鼠抗人VEGF抗體(稀釋度為13000)及鼠抗人GAPDH抗體(稀釋度為15000)，4 ℃孵育12 h后，TBST漂洗，加入相應二抗(稀釋度為15000)室溫孵育1 h，化學發光法顯影，成像系統拍照，ImageJ軟件分析各組灰度值。

1.2.6 翼狀胬肉臨床特征評價指標翼狀胬肉臨床特征評價指標參見文獻[6]。其中，翼狀胬肉血管分為3級，分別為1級：翼狀胬肉的體部薄如蟬翼，輕度充血，血管纖細，呈淡紅色；2級：翼狀胬肉的體部肥厚，血管擴張，密度增高，呈紅色；3級：翼狀胬肉體部明顯肥厚，血管怒張、致密，呈深紅色。翼狀胬肉透明度分為3級，分別為1級：透過翼狀胬肉體部能看清其下鞏膜血管；2級：翼狀胬肉體部下鞏膜血管欠清晰，少量可見；3級：從翼狀胬肉體部不能透見鞏膜血管。

1.2.7 翼狀胬肉病理特征評價指標翼狀胬肉病理特征評價指標參見文獻[7]。分別于40倍顯微鏡下隨機觀察5個不同視野，記錄上皮細胞層數、杯狀細胞數、成纖維細胞數、血管數及炎癥細胞數，均取平均值。纖維化程度分為4級，分別為0級：無纖維化；1級：少量血管周纖維化；2級：較多的血管周及局灶性纖維化；3級：彌漫性纖維化。變性程度分為4級，分別為0級：無彈性組織變性；1級：少量彈性組織變性；2級：較多的彈性組織變性；3級：彌漫性彈性組織變性。

1.3 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計數資料采用χ2檢驗。等級資料采用Mann-WhitneyU檢驗。雙變量相關性分析采用Spearman等級相關。計量資料采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 翼狀胬肉中VM的表達CD31/PAS雙重染色結果(圖1)顯示，血管內皮細胞CD31陽性(棕黃色)、血管壁PAS陽性(紫紅色)為具有血管內皮細胞的血管，而CD31陰性、PAS陽性的管道狀結構是VM的特有形態。經分析，10例正常結膜均未見VM結構，靜止期翼狀胬肉中VM陽性率為15.38%(8/52)，進展期翼狀胬肉中VM陽性率為68.50%(87/127)，靜止期與進展期翼狀胬肉中VM陽性率相比差異有統計學意義(P=0.000)；初發型翼狀胬肉中VM陽性率為40.80%(51/125)，復發型翼狀胬肉中VM陽性率為81.48%(44/54)，初發型與復發型翼狀胬肉中VM陽性率相比差異有統計學意義(P=0.000)(表1)。相關性分析結果顯示，VM與進展期翼狀胬肉(r=0.483，P<0.05)及復發型翼狀胬肉(r=0.374，P<0.05)均呈正相關。

表1 翼狀胬肉中VM與患者臨床資料的關系

2.2 翼狀胬肉中VM的表達與患者一般資料的關系統計得出，在不同性別、年齡及病程的翼狀胬肉患者的胬肉組織中，VM的表達差異均無統計學意義(均為P>0.05)(表1);翼狀胬肉分期、分型中VM的表達差異均有統計學意義(均為P=0.000)。

2.3 翼狀胬肉中VM與臨床特征的關系將翼狀胬肉的血管情況及透明度納入評價翼狀胬肉臨床特征的指標，結果顯示，在初發型進展期翼狀胬肉VM陽性組中，翼狀胬肉的血管分級明顯高于VM陰性組(P=0.000)，且VM與翼狀胬肉血管分級呈正相關(r=0.651，P<0.001)，而透明度分級在兩組間差異無統計學意義(P=0.635)(表2)。

表2 VM陽性組和VM陰性組翼狀胬肉組織的臨床病理特征差異分析

2.4 翼狀胬肉中VM與病理特征的關系HE染色可見(圖2)，在初發型進展期翼狀胬肉中，VM陽性組翼狀胬肉組織的上皮細胞層數、杯狀細胞數、成纖維細胞數、血管數、炎癥細胞數、纖維化程度均明顯高于VM陰性組(均為P<0.01)，而VM陰性組翼狀胬肉組織的變性程度高于VM陽性組(P=0.049)(表2)。相關性分析結果顯示，VM與翼狀胬肉組織的上皮細胞層數(r=0.846，P<0.001)、杯狀細胞數(r=0.868，P<0.001)、成纖維細胞數(r=0.729，P<0.001)、血管數(r=0.764，P<0.001)、炎癥細胞數(r=0.799，P<0.001)、纖維化程度(r=0.438，P<0.01)均呈正相關，與變性程度呈負相關(r=-0.642，P<0.05)。

圖2 HE染色顯示VM陽性組和VM陰性組翼狀胬肉組織的病理特征(×400)

2.5 翼狀胬肉中VM與MMP-2、MMP-9及VEGF的關系免疫組織化學染色結果顯示，翼狀胬肉組織中MMP-2主要表達于上皮細胞及血管內皮細胞，MMP-9主要定位于上皮基底細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞，VEGF主要于血管內皮細胞中表達。采用半定量積分法判定染色強弱，結果顯示，VM陽性組翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9及VEGF的表達均明顯高于VM陰性組，差異均有統計學意義(均為P<0.05)(圖3，表3)。

Western blot檢測結果顯示，VM陽性組翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9及VEGF的表達均明顯高于VM陰性組，差異均有統計學意義(t=19.419、16.535、13.000，均為P=0.000)(圖4)，與免疫組織化學染色結果相同。相關性分析結果顯示，翼狀胬肉中VM與MMP-2、MMP-9及VEGF的表達均呈正相關(r=0.367、0.378、0.329，均為P<0.05)。

表3 翼狀胬肉中VM與MMP-2、MMP-9及VEGF表達的關系

圖4 Western blot檢測VM陽性組和VM陰性組翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9及VEGF的蛋白表達 與VM陰性組相比，***P<0.001。

3 討論

翼狀胬肉是一種慢性退行性炎性病變，是眼科的常見病和多發病。李永平等[5]利用CD34/PAS雙重染色首次在翼狀胬肉組織中發現VM結構，但由于CD34在正常角膜緣和鞏膜組織中的纖維細胞也有陽性表達，故我們的研究選擇CD31/PAS雙重染色進一步重新驗證了翼狀胬肉中VM的存在，這與腫瘤組織中VM結構的檢測方法一致。

本研究結果顯示，翼狀胬肉中存在VM結構，而正常結膜中未見，且進展期翼狀胬肉中VM陽性率大于靜止期，復發型翼狀胬肉中VM陽性率大于初發型。我們的研究結果與李永平等[5]的結論共同支持了“VM結構不是腫瘤組織所獨有的血供模式”這一觀點。我們推測，VM是由于機體局部組織由于某些原因需要大量的營養供應，但自身血管不能滿足其需要而形成的一種供給方式。在進展期及復發型翼狀胬肉中，尤其是復發型翼狀胬肉，病灶進展速度快，需要較多的血液供應，故VM形成率較高。同時，大量VM結構的產生使翼狀胬肉獲得了充分的血液供應，極大地促進了翼狀胬肉的進展。

組織病理學上，眼表微環境的穩態主要由角膜緣干細胞維持，在紫外線或某些細胞因子等的作用下，角膜緣干細胞增殖、分化紊亂，即可導致眼部疾病的發生[8]。翼狀胬肉的典型病理特征包括上皮細胞增生、杯狀細胞增生、新生血管形成、炎癥細胞浸潤、成纖維細胞增生、纖維化及彈性組織變性等[9]。本研究通過對初發型進展期VM陽性和VM陰性翼狀胬肉的病理指標觀察發現，VM陽性組翼狀胬肉的上皮細胞層數及杯狀細胞數增加。有研究表明，翼狀胬肉凸出于眼表，破壞了淚膜的完整性，使角膜不能得到足夠的氧氣和營養供應，因此導致上皮細胞及杯狀細胞增生，分泌黏蛋白，維持淚膜的穩定。我們認為，VM陽性的翼狀胬肉組織具有較多的血管、炎癥細胞數及成纖維細胞，長勢較兇猛，其對淚膜的破壞更為嚴重，故其上皮細胞及杯狀細胞的增生較VM陰性組更為明顯。研究表明，許多細胞因子可通過激活ERK、p38/MAPK及JNK信號通路刺激杯狀細胞增生[10]，其中p38/MAPK及JNK信號通路還與炎癥密切相關，即杯狀細胞增生常伴有不同程度加重的炎癥反應，這與我們發現的VM陽性的翼狀胬肉杯狀細胞增生同時伴有炎癥細胞數增加這一結論相呼應。

李永平等[5]指出，翼狀胬肉中VM主要表現為PAS陽性的細胞外基質包繞在成纖維細胞伸出的突起表面形成的管道狀結構，即成纖維細胞是構成VM的主要成分之一，故VM陽性的翼狀胬肉可能具有較多的成纖維細胞。增生的成纖維細胞可產生過量的彈性蛋白，故VM陽性組翼狀胬肉的纖維化程度也較VM陰性組明顯。此外，成纖維細胞還可分泌如MMPs、VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等多種促進翼狀胬肉血管生成及炎癥反應的細胞因子，因此，VM陽性組翼狀胬肉中血管分級、血管數及炎癥細胞數也均高于VM陰性組。黃麗娜等[10]提出，進展期翼狀胬肉中基質淺層血管密度、成纖維細胞數、炎癥細胞數及纖維增殖程度均高于靜止期翼狀胬肉，復發型翼狀胬肉中這些病理指標又均高于初發型翼狀胬肉，即這些病理指標與翼狀胬肉的發生發展密切相關。故我們有理由推測，VM也與翼狀胬肉的發生發展密切相關。

本研究還發現，VM陽性組翼狀胬肉變性程度較低，可能是因為變性區域血管、炎癥細胞及成纖維細胞均較少，即此區域所需要的血液供應較少，不需要機體形成VM結構來補充養分，故變性程度越高的翼狀胬肉組織VM結構出現的越少。而VM與翼狀胬肉透明度無相關性，可能是因為血管密度及膠原纖維變性程度均可影響翼狀胬肉的透明程度。血管密度增加，翼狀胬肉的透明度降低，VM表達較多；變性程度增加，翼狀胬肉透明度同樣降低，而VM表達減少。

腫瘤VM的形成機制較為復雜，研究表明，MMPs幾乎能降解腫瘤細胞外基質所有的蛋白成分，在腫瘤侵襲和轉移中起關鍵性作用，且VM與MMPs表達量呈顯著正相關[11-12]。此外，在脈絡膜黑色素瘤組織中，VM陽性組織VEGF的表達均明顯高于VM陰性組織，且VEGF可以提高人類脈絡膜黑色素瘤細胞遷移、侵襲及VM形成能力；VEGF能夠激活PI3K，進而刺激MMP前體形成MMPs，共同促進腫瘤細胞形成VM[13-14]。與腫瘤組織相同，翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達均明顯高于正常結膜組織[15-16]。MMPs是一類與翼狀胬肉遷移和侵襲密切相關的蛋白水解酶，具有降解細胞外基質蛋白和基底膜中纖維網架分子的作用[17]，使翼狀胬肉中的細胞向角膜及深層浸潤。VEGF是目前發現的功能最強、最特異的促進血管形成的生長因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移和增殖等作用[18]。此外，VEGF與MMPs在翼狀胬肉形成過程中具有協同作用，共同參與翼狀胬肉的發展。

本研究結果發現，VM陽性組翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9及VEGF的表達均明顯高于VM陰性組，且VM與MMP-2、MMP-9及VEGF的表達均呈顯著正相關，即VM陽性的翼狀胬肉具有更強的促進翼狀胬肉細胞外基質蛋白降解、溶解角膜前彈力層及新生血管的能力，極大地促進了翼狀胬肉的進展。此外，有研究表明，進展期翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達均明顯高于靜止期，復發型翼狀胬肉組織中MMP-2、MMP-9和VEGF的表達又明顯高于初發型，即MMP-2、MMP-9和VEGF的高表達與翼狀胬肉發生發展密切相關[19]。故我們推測，VM也與翼狀胬肉的進展密切相關，MMP-2、MMP-9及VEGF可能參與翼狀胬肉VM的形成。

綜上所述，翼狀胬肉組織中存在VM結構，可作為其血供途徑之一，VM可促進翼狀胬肉的進展，MMP-2、MMP-9及VEGF可能是翼狀胬肉VM形成的分子機制。本研究也存在一定不足，由于半定量積分法判定染色強弱具有一定的主觀性，可能使試驗結果產生一定的誤差。此外，病例的地域局限性也可能對結果造成一定偏倚，仍需多中心、大樣本臨床研究來支持結論。

致謝：感謝南通大學附屬醫院眼科及眼科研究所全體老師在本研究工作上的支持與指導！