原代滑膜細胞培養及同時提取微量總RNA和蛋白質的方法在體外細胞分子生物學研究中的應用

熊翱，熊仁平，彭艷，黃治中，陳惺，江旭，曹福洋，許建中

原代細胞培養技術是廣泛應用于疾病體外研究的重要方法之一[1,2]，對原代培養的細胞進行分子生物學研究，可以排除其他細胞干擾，提高生物信息的準確性和特異性，進一步保證研究結論的可靠性。但原代細胞培養成功率低，有時純度達標困難。解決了純度問題，又會出現可用于實驗研究材料的原代細胞的代數不多，僅2～3代可用[3,4]，傳至4代以后的細胞就老化的問題，不能保持原代細胞原有的特征和功能。

采用傳代的原代細胞培養進行體外分子生物學研究，必須保證傳代細胞具有原有細胞的生物學行為；確保原代培養體系的細胞健康狀況良好；確保傳代細胞的任一組分功能與原有細胞都無差異。原代細胞的分子生物學研究中，核酸（RNA、DNA）和蛋白質一直是其研究的主要內容。以往國內研究人員從原代培養細胞中提取RNA和蛋白質，都是參考國內外文獻[5-7]，分別從原代培養細胞中提取。這樣提取RNA和蛋白質費時費力，更突出的缺點是浪費資源（需兩份培養細胞）、花費更多的經費（試劑重復使用）、操作繁鎖（易受外界RNA酶污染）、延長研究周期[8-10]。這就使原代培養細胞實驗研究工作的進展慢，不利于研究工作的順利開展。因此，如何對培養的可用于實驗研究的原代細胞做到物盡其用，從而節約經費、降低勞動成本、縮短研究周期是亟待解決的問題。

本研究為了最大限度地發揮原代細胞的作用，在成功培養Sprague-Dawley（SD）大鼠原代滑膜細胞的基礎上，探討從原代培養的具有滑膜主要功能細胞之稱的成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes,FLS）[11,12]中同時提取微量總RNA 和蛋白質。同時運用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和免疫印跡（Western blot）方法檢測滑膜原代FLS 的特征因子白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的mRNA 和蛋白質表達情況，同時與傳統的分別提取微量總RNA和蛋白質的IL-1β 和TNF-α 的基因和蛋白質表達情況進行比較，探討同時從一份原代培養細胞中提取微量總RNA和蛋白質的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

兩月齡SPF 級雄性SD 大鼠，200～240 g，購于陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心實驗動物中心［SCXK（軍）2017-0026］，飼養于陸軍軍醫大學陸軍特色醫學中心實驗動物中心［SYXK（軍）2017-0058］。動物實驗操作嚴格按照陸軍軍醫大學實驗動物倫理學要求執行（審批號：AMUWEC20181430），同時嚴格按照實驗動物使用的3R（Reduction，減少；Refinement，優化；Replacement，替代）原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（進口分裝，德國），DMEM（high Glucose，BI，美國）,雙抗（GiBco，美國），Ⅰ型膠原酶（abcam，美國），0.25%胰酶（GiBco，美國），小鼠抗vimentin 單抗（abcam，中國香港），兔抗IL-1β 多抗（abcam，中國香港），兔抗TNF-α多抗（cell signaling，美國），2×PCR mix（Bimake，美國），2×master mix（Promega，美國），TRIzolTMReagent（invitrogen，美國）。CO2培養箱（Thermo，美國），T100TM梯度PCR 儀（BioRad，美國），CFX ConnectTMqPCR 儀（BioRad，美 國），ELX800 酶標儀（BioTek，美國），Western blot 實驗系統（BioRad，美國）。所有器皿和所配溶液均按細胞培養和提取總RNA要求準備。

1.3 滑膜組織的分離、滑膜細胞的原代培養及其純度與增殖鑒定

參照熊翱等[13]建立的方法完成。

1.4 總RNA和蛋白質的提取

采用經鑒定的FLS 純度在98%以上的第6 代原代細胞，調整細胞密度為4×104/ml。0.2 ml/孔接種至6 孔板，培養至細胞融合度達80%時，調整并計數細胞。轉移原代培養細胞懸液至1.5 ml離心管，使其細胞數為5×105?？傆嫓蕚?2 份原代培養的第6 代FLS。每次的平行樣品數均為4。

1.4.1 經典法［酸性硫氰酸胍苯酚氯仿（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform,AGPC）］[14]提取總RNA試劑配制

檸檬酸鈉-月桂酰肌氨酸-β-巰基乙醇（citratesodium-sodium N-lauroyl sarcosinate-betamercaptoethanol,CSB）緩沖液（42 mmol/L 檸檬酸鈉，pH 4.0，8.3 g/L N-月桂酰肌氨酸和0.2 g/L β-巰基乙醇）；快速總RNA 提取試劑：用CSB 配制4 mol/L 異硫氰酸胍；加入0.15 體積4 mol/L乙酸鈉（pH 4.0）；加入等體積酸酚，混勻。4℃保存備用。

1.4.2 SDS-裂解法提取總蛋白質的試劑配制

預先配制10%（W/V）SDS 和0.5 mol/L Tris-HCl pH 8.0，室溫保存備用；預先配制1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），-20℃保存備用。提取總蛋白時，按以下配方現配SDS-裂解液：0.5%（W/V）SDS，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.1 mol/L DTT。

1.4.3 總RNA提取、質量、純度鑒定和濃度測定

取8份原代培養FLS細胞，低速離心，棄培養基，用含二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate,DEPC)的PBS洗滌2次，然后隨機分成兩組，每組4份。第一組加入AGPC RNA 提取試劑0.5 ml；第二組加入Invitragen 公司的TRIzolTM試劑0.3 ml。冰浴下超聲破碎細胞5 s×2次，4℃，孵育5～10 min。之后，每管加入100 μl冰浴后的氯仿，震蕩15 s。4℃靜置10 min后，12 000×g，4℃離心15 min，收集透明水相到新的離心管中（其余兩相供蛋白質提取用）。每管加等體積異丙醇（-20℃預冷），混勻，12 000×g，4℃離心10 min，棄上清，加75%乙醇洗滌并沉淀總RNA。真空或空氣干燥總RNA。最后用DEPC處理的超純水15 μl溶解沉淀。詳細總RNA 提取操作：AGPC 提取RNA 按文獻[14]方法改進執行；TRIzolTM法提取RNA 按Invitrogen的用戶指南介紹的方法改進執行。

取4 μl RNA 樣品加DEPC 處理過的雙蒸水至13 μl，加RNA載樣緩沖液7 μl，煮沸5 min后置冰中，然后上樣，進行0.8%甲醛瓊脂糖凝膠電泳（預電泳50 V，15 min；電泳60 V，40 min），檢查RNA 的完整性。主要觀察28 S 和18 S 兩條帶是否清晰，有無降解，以及是否有DNA污染。

取1 μl RNA樣品溶于99 μl DEPC處理過的雙蒸水中，用酶標儀測定在260 nm和280 nm波長處的吸光度。以A260值計數其濃度，1個A260單位=40 μg/ml RNA。計算公式：質量濃度（μg/ml）=A260×40×100（倍數）。

以A260/A280的比值表示其純度，比值在1.8～2.0 為純的核酸；比值低于1.8，說明RNA 樣品有蛋白質或酚污染，需用氯仿重新抽提。

1.4.4 熒 光qRT-PCR 檢 測FLS 的IL-1β 和TNF-α mRNA基因變化

利用promega 反轉錄試劑盒反轉錄總RNA 為cDNA[15]，梯度PCR儀優化選定PCR退火溫度。條件優化后進行IL-1β和TNF-α mRNA表達分析，復管，重復5次。PCR反應體系：2×反應混合物10 μl，消毒水7 μl，引物0.5 μl，cDNA 2 μl。PCR 條件：95℃10 s 變性，退火溫度[13]，59.0℃15 s退火，40個循環。55.0℃～95.0℃觀察溶解曲線。引物序列，參考文獻[16-18]并通過美國生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的Primer-Blast 比 對大鼠基因序列，完全正確。IL-1β mRNA（Forward：5′-CCTTGTGCAAGTGTCTGAAG-3′，Reverse ：5′-GGGCTTGGAAGCAATCCTTA-3′）；TNF-α mRNA（Forward：5’-CAAGGAGGAGAAGTTCCCA-3′，Reverse：5′-TTGGTGGTTTGCTACGACG-3′）；GAPDH mRNA（Forward：5′-TCTTCCAGGAGCGAGATCCC-3′，Reverse：5′-TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT-3′）。

1.5 蛋白質的提取及其濃度、純度和化學完整性鑒定

將TRIzolTM法提取RNA 途中留存的樣品，加入100 μl 100%乙醇混勻充分，室溫孵育3 min，2000×g，4℃離心5 min，吸取上清至新管中，加入600 μl 異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，12 000×g，4℃離心6 min，棄上清，加入800 μl 0.3 mol/L 鹽酸胍，95%乙醇重懸沉淀。室溫孵育20 min，6000×g，4℃離心5 min，棄上清。重復重懸沉淀兩次后，加入800 μl 100%乙醇混勻充分，室溫孵育20 min，6000×g，4℃離心5 min，棄上清，空氣干燥，5～10 min。每管加入200 μl 的1%SDS 在50℃水浴鍋中使沉淀充分溶解。10 000×g，4℃離心10 min，收集上清液到新試管中。詳細的TRIzolTM提取蛋白質法按Invitrogen 的用戶指南介紹的方法加以改進進行。常規提取培養細胞蛋白質方法按《分子克隆》介紹的用裂解緩沖液提取。

蛋白質濃度測定采用紫外光譜吸收法[19]，蛋白質溶液在波長280 nm 附近由于酪氨酸、色氨酸殘基有強烈的吸收。據此運用以下公式計算蛋白質含量：蛋白質含量（mg/ml）=F×（1/d）×A280，此處F 可查表，d為測量杯光徑（cm）。

蛋白質純度評估采用測定純化蛋白質的紫外光譜確定[20]。以A280/A260的比值表示其純度。比值在1.8～2.0為純的蛋白質；否則懷疑有核酸污染。

蛋白質化學完整性和生物反應能力檢測：采用考馬斯亮藍凝膠染色液染色SDS-PAGE結果，觀察蛋白質有無降解[21]；確定無降解后，采用免疫印跡法檢測FLS的功能蛋白IL-1β和TNF-α表達情況，鑒定所提蛋白質的質量。免疫印跡法具體操作步驟參考文獻[22,23]。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。免疫印跡檢測結果采用相對光密度值表示，熒光qRT-PCR檢測結果采用2-△△CT表示。數據以均數±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代滑膜細胞的培養、純度和增殖

采用腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠，劑量為2 ml/（kg·bw）。75%乙醇浸泡大鼠10～20 min，取雙側后膝關節（圖1A、1B）。分離的滑膜組織培養1 d 后，細胞絕大部分為梭形（圖1C）。培養第6 天（圖1D），細胞融合度達70%～80%，貼壁生長，但是仍然有極少的圓形、橢圓形細胞，進行傳代。培養第12～14 天（圖1E），第3 代細胞形態為梭形，核位于中央，生長良好。第8 代滑膜細胞增長緩慢，形態從梭形變為近似橢圓形，細胞間隙增大，有空泡、壞死、老化（圖1F）。第3 代FLS，免疫熒光化學（圖1G）和免疫組織化學染色（圖1H）觀察：形態規則，呈梭形，其細胞核為卵圓形位于細胞中央；波形蛋白（vimentin）染色滑膜細胞陽性率大于98%，vimentin為FLS特征性標志蛋白，提示培養的滑膜細胞為FLS；觀察第3～7代的FLS，增殖活躍，生長情況良好，從形態和特異性蛋白定位看為FLS，且純度高。通過對原代培養的第7代滑膜細胞的5-乙炔基-29-脫氧尿苷（5-ethynyl-29-deoxyuridine,EdU）增殖實驗，顯示仍有增殖能力（圖1I）。

圖1 SD大鼠正?；ぜ毎囵B及其鑒定

綜上，滑膜細胞原代培養的第3～7代FLS可作為后續實驗研究材料。

2.2 RNA的完整性、得率、純度[24]

用AGPC和TRIzolTM法提取的RNA[25,26]進行甲醛瓊脂糖凝膠電泳，18 S 帶和28 S 帶清晰可見，且28 S帶比18 S帶亮度強2～3倍，帶與帶之間無明顯拖尾現象，表明RNA 無降解，無明顯的DNA 污染（圖2A），RNA 樣品A260/A280的比值均在1.8 以上，說明RNA 未被蛋白質、酚污染，是高純度的。RNA 的最低濃度1.4 μg/μl，含量18.5 μg以上/5×105細胞，達到了AGPC和TRIzolTM法提取RNA的標準。用此RNA可進行多次qRT-PCR 分析，若用于耗RNA 量較大的Northern印跡法，也可滿足2次以上。

qRT-PCR分析IL-1β 和TNF-α mRNA表達，獲得成功。AGPC 和TRIzolTM法提取的FLS 總RNA 進行功能基因IL-1β 和TNF-α 表達分析，二者的2-△△CT值無明顯差別（圖2B）。

熒 光qRT-PCR 檢 測FLS 的IL-1β、TNF-α 和GAPDH mRNA 結果顯示：擴增曲線均成S 趨勢，溶解曲線一致，無雜峰。圖2C、D 顯示的是TRIzolTM法提取的總RNA 進行IL-1β 的qRT-PCR 分析所得的擴增曲線和溶解曲線。

圖2 AGPC和TRIzolTM法所提FLS總RNA的甲醛瓊脂糖凝膠電泳及IL-1β和TNF-αmRNA表達情況

2.3 蛋白質的得率、純度[24]和生物反應能力

用SDS 裂解緩沖液和TRIzolTM試劑提取的蛋白質[27]，進行SDS-聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳后，用考馬斯亮藍染色液染色凝膠，顯示分離效果好，無降解蛋白肽段（圖3A）。

通過測定蛋白質在波長280 nm 處吸收值，兩組方法得出總蛋白質80 μg以上/5×105細胞，完全可以滿足2～3次免疫印跡分析需要。兩種方法所提蛋白質樣品的A280/A260比值均在1.8以上，表明蛋白質純度達標。

免疫印跡法對IL-1β 和TNF-α 蛋白分析結果顯示：目的蛋白條帶均一，背景干凈，無雜帶（圖3B），這說明蛋白肽段完整性好，可與抗體有效結合，具有生物反應能力。

圖3 SDS-裂解和TRIzolTM法所提FLS總蛋白電泳分離后的考馬斯亮藍染色的凝膠圖像及IL-1β和TNF-α蛋白表達情況

3 討論

細胞原代培養技術是廣泛用于分子生物學體外研究的重要方法之一，但多數實驗室細胞原代培養的成功率不高，純度不夠，有穩定的母系細胞特征和功能的傳代細胞的代數較少。如何成功培養出原代細胞并建立從其培養出的有母系細胞特征和功能的少量原代細胞中提取所需的RNA 和蛋白質尤為重要。因此，建立原代培養方法和從同一份原代培養細胞中同時提取核酸蛋白的方法很有必要。本研究經過多次實驗，成功地培養出有FLS生理功能的原代滑膜細胞，FLS純度在98%以上，且原代培養細胞的第3～7代均可作為后續實驗研究材料[13]。在此基礎上，運用TRIzolTM試劑盒成功建立了從同一份原代培養細胞中同時提取總RNA和蛋白質的快速提取法。RNA和蛋白質的純度、完整性和生物學行為功能完全達標，試劑來源容易，操作簡便，適用于國內實驗室。

本研究對分離出的SD大鼠膝關節滑膜組織采用Ⅰ型膠原酶消化法進行原代培養，嚴控操作細節，獲得具有FLS 生理功能的原代細胞。原代培養出FLS的成功關鍵是嚴控細節操作。整個過程在無菌和冰浴下操作，減少細胞污染和死亡；銳性分離滑膜組織要盡可能剪碎滑膜組織，不要過濾，要磨平移液器吸頭，減少細胞物理損傷和污染機會；傳代消化終止后，重懸洗滌2次以上，減少胰酶對細胞的損傷；原代細胞進行傳代時，融合度不能超過80%，防止細胞接觸抑制、損害原代細胞的生物學行為和特征的穩定。

TRIzolTM試劑盒雖有從同一份標本中提取出RNA 和蛋白質的方法支持，但國內研究人員鮮有成功嘗試的報道。本研究經過多次重復和探索實驗，運用TRIzolTM試劑盒試劑，經過改良從同一份原代培養細胞標本中同時提取出RNA和蛋白質。與傳統提取方法比較，兩種方法提取的RNA 和蛋白質質量無差別。RNA和蛋白質的完整性和生物功能取決于最大限度地避免提純過程中內源及外源性的核糖核酸酶和蛋白酶對RNA和蛋白質的降解。同時還要防止機械高溫對RNA 和蛋白質的降解。為了確保所提RNA 和蛋白質的特征和功能，提取過程須在無菌和冰浴下操作，超聲破碎細胞不能超過5 s×3次，每次間隔1 min，嚴防RNA和蛋白質受熱和機械力持續而降解；RNA、DNA 和蛋白質的分相過程中，確保水相或管子處于無RNA酶狀態，確保水相無RNA酶和蛋白質污染，吸取上清，寧少勿多；在100%乙醇去除中下層中的絮狀DNA 時，吸取上清，寧少勿多，確保蛋白質的純度；最后，在RNA 和蛋白質的洗滌過程中，尤其是蛋白質，離心力不宜太大，離心時間不宜太長，防止增加溶解RNA和蛋白質沉淀的難度。

傳統方法提取RNA和蛋白質，多種試劑分別加入兩份原代細胞，多環節操作，增加了RNA和蛋白質的污染和降解機會，從而增加了操作難度。把RNA和蛋白質放在同一份標本中提取，簡化了操作步驟，可比性好。不但節省時間，提高了工作效率，而且減少了RNA和蛋白質降解的機會，無需單獨提取RNA和蛋白質所需的RNA酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。

4 結論

本研究建立的同時提取FLS原代細胞微量RNA和蛋白質的方法，操作簡便，高效快速，經濟實用。通過FLS總RNA 的0.8%變性甲醛凝膠電泳監測、實時熒光定量PCR對FLS的功能分子分析及FLS總蛋白質的SDS-PAGE監測、免疫印跡法實驗印證功能分子表達，證明了同時提取的FLS 原代細胞RNA 和蛋白質純度高、完整性好，具有母系細胞的生物學行為功能，完全適用于體外培養細胞的分子生物學研究，預示此方法將有良好的應用前景。本研究建立的提取方法，對除FLS 外的原代細胞的微量RNA 和蛋白質同時提取也有借鑒作用。

從FLS原代細胞中同時提取微量總RNA和總蛋白質，得率高、純度好，具有化學完整性和生物反應能力，有利于體外細胞分子生物學研究。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突