BMP4 基因對合作豬絨毛生長發育的影響

李 嬌 ，陳嘉璇 ，劉翁博洋 ，林上遠 ，黃曉宇 ，2＊，滾雙寶 ，2

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現代養豬工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070）

骨形態發生蛋白家族十分獨特,可誘導IOPC類細胞向成骨細胞方向轉化。研究表明，BMPs在造血組織、皮膚附屬物等的形成和分化以及脂肪、腎臟、肝臟、骨骼及神經系統發育中起一定作用。BMP與胚胎發育過程中骨骼的發生有時空相連性，在胚胎發育的所有組織中均可檢測到低水平BMP4基因mRNA表達。M.Menzies等研究表明，BMP4基因在胎羊毛囊不同發育階段與Noggin基因共同參與了毛囊發育的調控，是細毛羊毛囊發育的關鍵決定因子。G.Thomadakis等、J.M.Wozney等研究表明，BMP4在毛囊發育時及毛球中合成角蛋白的表皮細胞中表達。通過觀察表達BMP4基因的頡頏物Noggin的轉基因小鼠，發現其毛發異常且形態發生改變。在絨山羊不同發育時期皮膚中的表達結果表明，BMP4基因在胚胎期上皮細胞、毛囊以及出生后毛囊生長興盛期、退行期和休止期均有表達，表明其與毛囊形態發生以及出生后毛囊的發育、分化密切相關。目前，對BMP4基因與家畜皮膚毛囊關系的研究主要集中在絨山羊，尚未發現BMP4基因與豬毛囊發育方面的相關報道。本研究通過實時熒光定量PCR技術，檢測BMP4基因在合作豬頸部、肩部、體側、臀部皮膚的表達量，實驗結果可為揭示BMP4基因對合作豬絨毛生長發育的調控機制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

本實驗選取冬、夏季兩個季節合作豬的頸部、肩部、側部、臀部四個部位皮膚樣品，通過RT-qPCR方法檢測BMP4基因在春、夏季合作豬皮膚中的基因表達量。具體的動物實驗過程如下：

將1 2 頭（冬、夏季各6 頭）實驗豬屠宰后快速采取皮膚組織，用PBS緩沖液清洗、標記后迅速置于液氮中冷凍，帶回實驗室轉移至-8 0 ℃冰箱長期保存。實驗所需合作豬由甘肅省現代養豬工程技術研究中心科研及人才培訓基地—甘肅省甘南州迭部縣尼傲鄉蕨麻豬養殖專業合作社提供。

1.1.2 主要試劑、耗材

Trizol試劑，PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒，合作豬各組織的cDNA，BMP4基因的上下游引物、無酶水、內參等。

1.2 引物設計與合成

以GenBank中豬BMP4基因核苷酸序列（NM_001101031.20）和氨基酸序列（NP_001094501.1）為參考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0，設計BMP4基因的熒光定量PCR特異性引物，合成引物，序列見表1。

表1 熒光定量PCR 引物設計

1.3 總RNA 提取和cDNA 合成

采用Trizol萃取法提取實驗組和對照組合作豬頸部、肩部、體側、臀部的組織的總RNA，并分別檢測RNA完整性和純度，將得到的cDNA保存在實驗室-20℃的冰箱中。

1.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量反應：上下游引物各為0.8 μL，cDNA模板2 μL，內參均0.8 μL，sybr酶10 μL，RNase Free H2O補足至20 μL。反應條件為：95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35個循環。所有組織都做4個樣品，每個樣品同時做3個技術重復。以2-ΔΔCt法計算相對表達量，用SPSS 26.0軟件進行數據分析，以平均數±標準差表示結果，最終結果通過Graphpad Prism 8.0以圖片的形式展現出來。

1.5 生物信息學分析

從NCBI的GenBank數據庫中下載獲取各物種的BMP4基因的氨基酸序列：野豬（登錄號：NP_001094501.1）、狗（登錄號：NP_001274099.1)、家牛（登錄號：NP_001039342.1）、野馬（登錄號：XP_023507423.1）、人（登錄：NP_001193.2）、綿羊（登錄號：NP_001103747.1）、雞（登錄號：NP_990568.4）、鼠（登錄號：NP_001303289.1）、大猩猩（登錄號：XP_004055236.1），猴（登錄號：XP_012306449.1），兔（登錄號：NP_001182652.1），用MEGA5.0軟件進行序列比對、分析，采用表2工具進行BMP4基因的生物信息學分析。

表2 生物信息學分析軟件工具

2 結果與分析

2.1 基因擴增曲線

通過圖1可以得知，BMP4基因和內參基因在擴增時，指數期條帶走向一致且清晰，由此說明cDNA的濃度合適，適應于采用該實驗進行熒光定量分析。

圖1 BMP4 基因和內參基因的擴增曲線

2.2 基因溶解曲線

通過圖2可知，BMP4基因和內參基因的溶解曲線的多個重復均曲線一致性較好，沒有多余的雜帶出現，證明實驗設計的引物良好，適合后續的實驗分析。

圖2 BMP4 基因和內參基因的溶解曲線

2.3 BMP4 基因在不同組織中的表達分析

采用qPCR檢測合作豬各組織中BMP4基因的表達水平，發現冬季合作豬的頸部、肩部、側部和臀部的BMP4基因的表達量顯著高于夏季（P＜0.05）（表3和圖3），這個結果說明BMP4基因有抑制毛囊生長發育的作用，提示BMP4基因影響合作豬絨毛生長發育。

表3 合作豬不同部位、不同季節BMP4 基因的表達量

2.4 系統進化樹分析

利用MEGA5.0軟件分析豬與狗、普通牛、人、綿羊、家鼠，雞、大猩猩、野馬、兔子和猴的核苷酸序列，制作出圖4。由圖4可知豬與牛、野馬、綿羊親緣關系較近，而與人、家鼠、猴和兔的遺傳關系較遠，該結果與動物分類相一致。

圖4 BMP4 基因系統進化樹結果圖

2.5 蛋白理化性質分析

Prot Param 在線服務器分析結果顯示，豬BMP4基因編碼409個氨基酸，分子式為C2055H32221N620O597S16，等電點約為8.57，半衰期為30 h，如表4。

表4 合作豬BMP4 基因編碼蛋白的氨基酸組成

2.6 蛋白親疏水性分析

ExSyPA-ProtScale軟件可用于氨基酸殘基的親疏水性預測，發現BMP4蛋白氨基酸殘基的第307位賴氨酸親水性是最強的，親水值為-3.300；第14位半胱氨酸的疏水性最強，疏水值為+2.978；總平均親水性為-0.565，平均值為負，說明豬BMP4蛋白可能為親水性蛋白，如圖5。

2.7 蛋白二級結構與三級結構預測

利用S O P M A軟件和S w i s smodel軟件對BMP4基因編碼蛋白的二級結構和三級結構進行預測分析，結果顯示：BMP4蛋白主要由α-螺旋和無規則卷曲構成（圖6），其中α-螺旋占24.69%，無規則卷曲占比53.79%，β-轉角所占比例為2.44%，這些二級結構單元進一步扭曲、折疊，形成了三級結構（見圖7）。

圖6 豬BMP4 基因編碼蛋白二級結構預測

圖7 豬BMP4 蛋白三級結構預測

2.8 信號肽剪切位點預測

運用SignalP軟件預測，結果表明BMP4蛋白存在信號肽，且信號肽的剪切位點位于第24和25號氨基酸之間，如圖8。

圖8 豬BMP4 基因編碼蛋白的信號肽位點預測

2.9 蛋白保守性預測

運用NCBI在線工具CDD預測保守結構域，結果顯示豬BMP4蛋白含有兩個超家族保守結構域，即TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族，其分別位于303～409位氨基酸殘基與41～276位氨基酸殘基（圖9）。

圖9 豬BMP4 蛋白保守結構域預測

注：*表示P＜0.05，差異顯著

2.10 合作豬BMP4 基因編碼蛋白亞細胞定位

采用PSORT II軟件進行亞細胞定位。結果表明：BMP4基因編碼蛋白有47.8%的可能性分布在細胞核，在細胞骨架、細胞質和高爾基體的可能性分別為13.0%、8.7%和4.3%。

3 討論與結論

倪蓉研究表明，BMPs對動物生長發育、骨骼形成、創傷愈合、機體疾病等方面具有重要作用,且在毛囊發育過程中發揮調控作用。BMPs信號通路可誘導內源性Dsmoglein 4的表達,從而調控毛囊生長周期,維持毛發濾泡的穩定性,平衡毛發的自我增殖與凋亡。BMPs信號受阻會導致毛囊瘤的形成。M.Blessing等研究表明：BMP4主要會在成熟毛囊的毛乳頭表達；若在轉基因小鼠的毛囊外根鞘中過表達,就會抑制毛母質細胞增殖，激活外根鞘中毛角質蛋白基因表達，還會導致外根鞘及基質細胞增殖。顧華等研究表明，不同濃度的BMP4均可促進毛囊外根鞘細胞的增殖和遷移。毛干的分化是產生毛發的前提，若沒有BMP4基因的參與，毛干分化受阻，毛發也不能形成。

為了研究BMP4基因對合作豬絨毛生長發育的影響，本實驗對BMP4基因進行克隆、測序和生物信息學分析，結果表明：BMP4基因編碼了409個氨基酸，半衰期為30 h，是一種親水性蛋白，含有TGFb-propeptide超家族和TGF-beta-SF超家族保守結構域，沒有跨膜結構域，存在信號肽位點。BMP4基因主要由α-螺旋（24.69%）、無規則卷曲（53.79%）和β-轉角（2.44%）組成。系統進化樹結果表明豬與馬、牛、綿羊等親緣關系較近，這與動物分類結果一致。這些結果可以為豬BMP4基因的相關研究提供參考。

注：Score0 表示疏水性；Score0 表示親水性。

毛青青等研究表明，BMP4基因在毛囊和羽毛發生發育過程中表達且主要起負調控作用。對毛囊再生，BMP4起抑制作用。吳江鴻等發現，BMP4基因在絨山羊皮膚次級毛囊上表達效果不同，休止期高表達，興盛期低表達，可調節山羊絨的周期性生長，推斷BMP4基因可能參與調控毛囊發育，并在其中起抑制作用。

本文研究了豬BMP4基因的生物學特性，并檢測夏季和冬季BMP4基因在合作豬豬體中的表達變化與合作豬周期性生長絨毛有關，冬季BMP4基因表達量高于夏季，初步推測：BMP4具有抑制毛囊生長發育的作用，當其表達量超過一定強度時就會抑制毛囊的生長發育，導致毛囊密度減少。本研究結果為探索合作豬絨毛生長調控分子機制和尋求育種與營養手段控制絨毛生長提供新的思路和方向，而且也將為毛發周期性生長調控機制提供理論依據。

（收稿日期：2022-03-14)