基于分子對接與網絡藥理學探討蘇黃止咳膠囊治療咳嗽變異性哮喘的作用機制

張恩铚 杜丹陽 劉利根 石心紅

摘要 目的：通過分子對接與網絡藥理學技術，深度發掘蘇黃止咳膠囊主要活性成分，明確其作用靶點與信號通路，分析其治療咳嗽變異性哮喘（CVA）多靶點、多通路的干預作用機制，闡明蘇黃止咳膠囊（SH）的藥效物質基礎及作用機制。方法：依托于網絡藥理學技術與分子對接技術，從SH中篩選活性化合物，并對其通路進行分析。結果：篩選得到75個活性化合物，其中麻黃與前胡所含化合物占比最多，各為16種，其余依此為紫蘇子13種、枇杷葉11種、五味子7種、牛蒡子5種、地龍4種、紫蘇葉3種。共得到CVA相關靶點429個，共得到相關通路316條，其中涉及相關疾病信號通路2條，與炎癥相關通路4條，肺損傷保護通路1條。結論：本文初步探討了SH的主要活性活性成分、相關靶點及涉及通路，預測其治療CVA的藥效物質基礎及其作用機制，為后續處方二次開發優化及臨床治療CVA的療效評價指標提供參考與物質基礎。

關鍵詞 分子對接;網絡藥理學;蘇黃止咳膠囊;咳嗽變異性哮喘;作用機制

Mechanism of Suhuang Zhike Capsules Against Cough Variant Asthma Based on Molecular Docking and Network Pharmacology

ZHANG Enzhi，DU Danyang，LIU Ligen，SHI Xinhong

（School of Traditional Chinese Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

Abstract Objective：To explore the main active components of Suhuang Zhike Capsules（SH），identify the targets and signaling pathways，analyze the multi-target and multi-pathway intervention mechanism in the treatment of cough variant asthma（CVA），and clarify the pharmacodynamic material basis and mechanism of action of SH based on molecular docking method and network pharmacology.Methods：Based on the network pharmacology and molecular docking，active components of SH were screened out and the corresponding pathways were analyzed.Results：Seventy-five active components were screened out from SH，and Ephedrae Herba and Peucedani Radix contained the largest proportions of components，16 for each one，followed by Perillae Fructus for 13，Eriobotryae Folium for 11，Schisandrae Chinensis Fructus for 7，Arctii Fructus for 5，Pheretima for 4，and Perillae Folium for 3.In addition，a total of 429 targets related to CVA and 316 pathways were obtained，including two disease-related signaling pathways，four inflammation-related pathways，and one protection pathway against lung injury.Conclusion：The present study preliminarily discussed the main active components，related targets，and pathways involved in SH and predicted the pharmacodynamic material basis and mechanism of SH against CVA，which is expected to provide references and material basis for the subsequent optimization of prescription modification and research on the efficacy evaluation indexes in the clinical treatment of CVA.

Keywords Molecular docking;Network pharmacology;Suhuang Zhike Capsules; Cough variant asthma;Mechanism of action

中圖分類號：R285;R256.12文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.10.003

咳嗽變異性哮喘（Cough Variant Asthma，CVA）是臨床上一種較為特殊的哮喘類型，是導致成人慢性咳嗽的主要病因。臨床特點主要表現為持續性或慢性咳嗽，在清晨和夜晚咳嗽尤為劇烈，冷空氣、感冒、油煙等會加重咳嗽[1]?；颊邿o明顯臨床感染表現，亦無呼吸困難、氣促、明顯喘息等。一般認為CVA是哮喘或其亞型的前期，也將其稱之為隱匿性哮喘[2]。當前有關CVA的具體發病機制尚不明晰，西醫主要以支氣管擴張劑與吸入激素治療為主，但存在患者接受及依存性差等問題，無法堅持長期治療，病情會反復發作。研究顯示，蘇黃止咳膠囊（SUHUANG ZHIKE JIAONANG，SH）治療變異性哮喘已取得不錯的臨床療效[3]，但其療效與西醫治療相比是否存在差異尚無統一定論。0C78C04D-8860-4BF5-ABFB-98B024AB37B0

SH是由中日友好醫院晁恩祥教授依據臨床40余年的經驗研制而成，是目前上市中成藥中唯一可治療《諸病源候論》中所記載“風咳”一病的藥物，在現代醫學中，該產品也是針對CVA和感冒后咳嗽所研制[4]。該膠囊由九味藥所組成，分別為麻黃、紫蘇葉、蟬蛻、五味子、前胡、地龍、牛蒡子、蜜枇杷葉和紫蘇子[5]。SH是于2001年國家中醫藥管理局的新藥創新基金項目立項的項目，在新藥指導下所研制出來，經臨床應用證明具有較好的臨床效果[6]。但有關SH治療CVA的具體活性組分/成分、目標靶點及其作用機制并未完全闡明。因此，本研究將以SH作為研究對象，借助分子對接與網絡藥理學技術，通過搭建成分-靶點-通路-疾病網絡，系統全面地研究活性成分、作用靶點與疾病間的相互連接關系及密切程度，闡明SH中所含有的藥效物質基礎，以及治療相關疾病的具體通路，為之后深入闡述SH治療CVA的具體作用機制提供科學依據，以期為中醫藥臨床治療CVA提供理論基礎及參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），Pharm Mapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html），Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SIB數據庫（http：//www.molecular-modelling.ch/swissdrugdesign.php），GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/），UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/），STRING（Functional Protein Association Networks）數據庫，DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/），Integrity數據庫（https：//integrity.clarivate.com/integrity/xmlxsl），Metascape數據庫（https：//metascape.org/gp/index.html），UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org），RSB數據庫（https：//www.rcsb.org），Cytoscape軟件（version 3.6.1），分析工具Network Analyzer及插件CytoNCA、MCODE，Chimera 1.14分子對接軟件，Autodock vina 1.1.2插件。

1.2 研究方法

1.2.1 活性成分的搜索與篩選 首先通過國家知識基礎設施數據庫（China National Knowledge Infrastructure，CNKI）查詢SH近年研究，明確組成SH的各類中藥，利用TCMSP檢索SH中麻黃、紫蘇葉、蟬蛻、五味子、前胡、地龍、牛蒡子、蜜枇杷葉和紫蘇子所含化合物。以麻黃為例，輸入關鍵詞“麻黃”，搜索得到其相關活性成分，根據藥物的ADME（Absorption、Distribution、Metabolism、Excretion）特性，設定口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）大于30%，類藥性（Drug Likeness，DL）需大于0.18，在此條件下篩選得到麻黃成藥性較高的化學成分作為活性成分。依此篩選出具有明確CAS編號的活性成分作為成分庫。

1.2.2 活性成分潛在作用靶點的篩選 將之前已篩選好的活性成分CAS編號依次輸入到PubChem數據庫中，下載其相關SMILES化學式及3D結構式（文件格式為SDF）。之后登錄Pham Mapper數據庫（反向藥效團匹配數據庫），將下載好的活性成分3D結構圖上傳，設置默認靶點數為300，點擊Submit（提交），得到有關各個活性成分得分排名前300的靶點。其次，登錄SIB數據庫，將之前得到的SMILES化學式導入數據庫，得到各活性成分對應的靶點。最后將2個數據庫所得靶點取并集，作為SH的潛在作用靶點。

1.2.3 疾病潛在作用靶點的篩選 首先通過Integrity數據庫搜尋關于CVA的正式英文表達，即Cough Variant Asthma。登錄GeneCards數據庫及DisGeNET數據庫，輸入上述英文表達，得到其疾病對應的作用靶點，將上述2個數據庫所得靶點進行統一并取并集，即得CVA的總疾病靶點。

1.2.4 成分-靶點-疾病網絡模型構建與分析 將上述所得SH總靶點與CVA總靶點取交集，得到SH治療CVA的潛在作用靶點，將數據進行歸納整理，使其符合軟件標準，將成分、靶點、疾病數據導入Cytoscape軟件（version 3.6.1），繪制成成分-靶點-疾病網絡圖，并通過運用Network Analyzer、CytoNCA等插件及網絡拓撲性質進行數據分析。

1.2.5 疾病靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建 STRING數據庫是一個進行在線搜索與構建當前已知蛋白質-蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）網絡的數據庫，現在已更新到了11.0版本，數據庫里已存儲5 090個物種，約2 460萬種蛋白，及超過20億條PPI的信息。將之前篩選所得成分-疾病共同作用潛在靶點信息輸入到STRING數據庫，將蛋白種類設置為Homo Sapiens（智人），網絡搭建依據設置為Evidence（證據），最低PPI閾值設定為High Confidence（高可信度0.7），同時勾選Hide Disconnected Nodes In The Network（隱藏網絡中無關聯節點），其余保持默認設置，點擊Export（導出），選擇下載其TSV格式文件，將下載文件導入Cytoscape軟件，開始構建靶點PPI網絡圖。0C78C04D-8860-4BF5-ABFB-98B024AB37B0

1.2.6 基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 Metascape數據庫是一個提供基因注釋與分析資源的門戶網站，其自帶自動化元分析工具，支持在線富集通路分析，具有數據更新快，資源庫豐富，簡便操作等優勢。登錄Metascape數據庫，將之前篩選所得疾病對應作用靶點信息導入庫內，點擊Submit（提交），將物種設置為Sapiens（人類），接著點擊Custom Analysis（個性化分析），進入相應界面后，點擊Enrichment（富集），設置通路為KEGG Pathway，其余選項均不勾選，最后點擊Enrichment Analysis（富集分析），進入分析報告頁，得到相關分析結果。GO分析如上，分別選擇對應通路即可。

1.2.7 成分-靶點網絡藥理拓撲學性質分析 網絡藥理模型構建后，使用Cytoscape軟件自帶插件Network Analyzer及CytoNCA，對該模型進行網絡拓撲分析，得到各節點的介數中心度（Betweenness Centrality，BC）、距離中心度（Closeness Centrality，CC）和等級值（Degree）。通過對上述3組數據進行分析，得到該網絡模型中具有樞紐作用的活性成分?；诰W絡藥理學算法理論，除去氧哈林通堿外，從單個活性成分-靶點網絡角度考慮，上述活性成分可能代表了SH主要療效。而從靶點角度來看，單個靶點受到的活性成分影響越多，則說明SH對該靶點的可調控可能性越高。

1.2.8 潛在活性成分-靶點分子對接驗證 首先將成分-靶點-疾病網絡模型中Degree參數均值作為參考條件，以此篩選出大于均值的核心活性成分，進入TCMSP，下載相關核心活性成分的MOL2文件。之后再進入RSB數據庫（https：//www.rcsb.org）下載關鍵靶點蛋白的3D結構文件（PDB格式），將靶蛋白文件導入Chimera 1.14軟件，對每個蛋白分子進行Minimize優化及去水加氫處理，并移除其原配體;同時導入核心活性成分，除移除配體外，處理方式同上。運行Autodock Vina 1.1.2插件，設置Binding Pocket區域范圍，進行分子對接，對得到結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 活性成分篩選 初步得到95種化學成分，CAS編號共得到75種化合物。在所得化合物中，麻黃含有16個，枇杷葉含有11個，前胡含有16個，牛蒡子含有5個，五味子含有7個，紫蘇子含有13個，紫蘇葉含有3個，地龍含有4個。SH篩選所得化合物基本信息。見表1。

2.2 成分-靶點-疾病網絡模型構建與分析 潛在作用成分-靶點-疾病網絡相互作用模型綠色橢圓代表SH潛在活性成分，黃色長方形代表作用靶點，紅色菱形則代表疾病。該圖中共包含了505個節點（包括化學成分75個，靶點429個，疾病1個）與4 419條邊（其中成分-靶點3 991條，靶點-疾病428條），圈內的綠色與黃色節點則表示Degree值較大的成分與靶點，即越接近圈中心，比重越大。見圖1。圖2中，SH的每個潛在活性成分平均連接于53.21（3 991/75）個靶標，而同時每個靶點又平均連接9.30（3 991/429）個藥物活性成分，這種多活性物作用同一靶點與多靶點作用同一活性物的現象充分展現了中藥多成分協同作用多靶點的特色。同時，從活性物角度來看，作用超過60個靶點的化合物占總化合物的5.3%，整個網絡體系中，SH內應存在可作用于大部分靶點的少數關鍵化合物。

2.3 成分-靶點網絡藥理拓撲學性質分析 成分-靶點網絡模型中具有樞紐作用排名前8的活性成分分別為Deoxyharringtonine（去氧哈林通堿）、（E）-（4-methylbenzylidene）-（4-phenyltriazol-1-yl）amine、Prodelphinidin B6、praeruptorin E（紫花前胡素E）、isoegomaketone（異紫蘇酮）、Farnesiferol A（法尼斯淝醇A）、Pectolinarigenin（柳穿魚黃素）、Herbacetin（草質素），其中Deoxyharringtonine（去氧哈林通堿）為抗腫瘤類成分，故排除。分析發現有約24%的靶點與不少于15個活性成分相互作用，在此之中又有26個靶點鏈接超過30種活性成分。

2.4 PPI網絡分析 K-Core值超過5的模塊共有5個，這些蛋白之間存在著比較緊密的聯系，可能共同作用于某個生物過程。其中模塊5和模塊4與信號轉導有關，模塊3則與細胞周期調控相關。見圖3。對模塊1分析，發現其中存在大量與炎癥相關靶點，調控炎癥反應，參與炎癥應答及細胞防御應答。見圖4。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析 在GO富集分析中，含生物過程（Biological Process，BP）條目8 036條，細胞組分（Cellular Components，CC）條目713條，分子功能（Molecular Function，MF）條目1 384條，KEGG通路分析得到通路共316條，各類別排名前20的通路見圖5。

在KEGG前20條通路中，分子信號通路占7條，疾病信號通路占13條，包含Influenza A、PI3K-AKT、Th 17、IL-17、HIF-1、Pertussis、核因子κB（NF-κB）等。其中Influenza A、Pertussis為流感咳嗽相關通路，可誘發咳嗽變異性哮喘的發生與發展。Th 17、IL-17、NF-κB、HIF-1為炎癥相關信號通路，PI3K-AKT為肺損傷保護相關通路[10-11]。

PI3K-AKT信號通路主要包括2個關鍵蛋白，即3-磷酸肌醇激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）與絲/蘇氨酸蛋白激酶（AKT）。在細胞的增殖與成活中發揮著重要作用[12]。經PI3K激活的AKT，進一步抑制或激活下游Caspase9、Bad、Forkhead、NF-κB、mTOR、P21、Par-4等分子，從而介導胰島素和多種生長因子所誘發的細胞生長，促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節通路[13]。有研究發現，通過調節PI3K-AKT信號通路中相關分子的表達，可有效改善哮喘模型小鼠的氣道重塑，達到治療哮喘的目的[14]。Th 17細胞以分泌IL-17（白細胞介素-17）而得名，Th 17細胞及分泌出的IL-17在氣道重塑及氣道高原反應過程中發揮重要作用。Koga等[15]發現激素抵抗型哮喘模型小鼠的氣道炎癥和氣道高原反應可被Th 17細胞所介導。Rudner等[16]利用上皮細胞在小鼠體內過量分泌IL-17，發現小鼠支氣管及細支氣管上皮細胞增生肥大，同時伴隨肺實質中嗜酸性粒細胞和巨噬細胞浸潤。NF-κB是細胞中重要的轉錄調節因子，有研究顯示，在哮喘發生、發展過程中，NF-κB信號通路在其中發揮著重要作用[17-18]。王金磊等[19]發現在哮喘大鼠模型中，可通過抑制NF-κB信號通路來達到改善哮喘大鼠的氣道炎癥及細胞損傷。HIF-1（缺氧誘導因子）由HIF-1α和HIF-1β 2個亞基組成，在低氧狀態下可激活多種靶基因的轉錄，并且對于細胞生長發育和生理應激及在某些病理過程中發揮重要作用。當前已發現在過敏性氣道炎癥發展中HIF-1α存在過度表達[20-21]。有研究通過藥物進行干預，下調HIF-1α表達，可使哮喘氣道炎癥反應得到明顯緩解[22-24]。0C78C04D-8860-4BF5-ABFB-98B024AB37B0

2.6 潛在活性成分與關鍵靶蛋白的分子對接結果? 根據Degree值篩選得到前五位活性化合物：（E）-（4-Methylbenzylidene）-（4-Phenyltriazol-1-Yl）Amine、Prodelphinidin B6、Praeruptorin E（紫花前胡素E）、Isoegomaketone（異紫蘇酮）、Farnesiferol A（法尼斯淝醇A）。研究表明，配體與受體相結合，所需結合能越低，則說明其結合構象越穩定，即結合可能性越高[25]。本研究結果顯示，SH與CVA共同作用靶點結合能（Bind Energy）均為負值，說明在化合物與靶點蛋白間均有結合活性，當結合能小于-5 Kcal/mol時說明具有較強結合活性，當小于-7 Kcal/mol時則有強烈結合活性[26-27]。分子對接結果見圖6，其中相對有較強結合活性的化合物與靶蛋白分子對接模式部分見圖7。結果說明SH的潛在活性成分與交集靶點蛋白之間結合性能一般，因此在之后的SH相關藥效動力學研究中應將蛋白間結合能納入影響因素來綜合考量。

3 討論

在PPI網絡圖中，蛋白間的連線數量越多，相互關聯程度越高，則說明此蛋白在治療疾病中發揮的藥理作用較為明顯[7]。在該圖中，其節點大小由Degree決定，顏色由暗色到亮色的轉變則取決于BC，線條的粗細及顏色則代表了邊介數和合并分數。對該PPI網絡圖進行拓撲學分析，得到此網絡中的樞紐蛋白，按照等級值進行選取。相關研究發現，SATA3在各類炎癥性疾病發病過程中發揮著重要作用，當前已證明抑制該蛋白可對疾病進展起到緩解作用[8]。而IL-6則是當前發現的功能最為廣泛的細胞因子之一，參與調節免疫反應、細胞增殖分化等，同時作為炎癥介質，具備促炎與抗炎雙重作用[9]。

CVA亦稱作隱匿性哮喘或咳型哮喘，是一種潛在的哮喘表達形式，同時亦為引發兒童慢性咳嗽的最常見疾病之一。此病最早于1972年由Glauser[28]報道，在1975年后該病患者也相繼被報道[29-30]。直到1982年由Hannaway和Hopper[31]才正式建立有關CVA的診斷?？人耘c喘息都是哮喘的癥狀，但早前人們只有在出現喘息時才能判斷為哮喘，這是一種錯誤理解。臨床上被診斷為上呼吸道感染、支氣管炎或慢性咳嗽尚未診明的患者中，有許多人實際上就是CVA。

該病病因未完全明確，發病機制較為復雜，一般認為其發生受到環境與遺傳雙重因素影響。本研究結果顯示，CVA的發病與病毒感染、免疫功能調節等有關。揭示了Th 17細胞通路、NF-κB通路、IL-17細胞通路、HIF-1細胞通路、PI3K-AKT等通路在CAV發病機制中的作用。

在中醫論著中，尚無與CVA完全對應的病名。該病具有反復發作等臨床證候特點，且多與外邪侵襲（風、寒、燥、火）有關，其發病與感冒的發生發展有密切聯系。感冒之后，六淫余邪未除;或因過量食用生冷、清熱苦寒的食物及使用大量抗生素等，則體內風寒、濕冷久留不去，不去則熱，又風熱之邪被遏，五臟寒熱錯雜，內生痰濕，附著于肺，則咳嗽久久不愈;咳而不愈則致肺傷，故肺氣虧虛，虛者，則風冷之氣更易伏于肺絡，留積于內，正邪相搏，氣道壅澀，故久咳不止。從中醫角度來看，CVA的病機本質實則為外感失治，邪郁于肺絡，肺氣失宣，肺管不利，氣道攣急所致[32]。

SH為晁恩祥教授依據多年臨床經驗所創立，患者在服用后均得到了較為滿意的臨床療效，且減少了激素類藥物的使用頻率。但由于其處方組成復雜，化學成分較多，其具體作用機制未能得到明確闡述。網絡藥理學研究有著整體性與信息及時性等特性，可將成分及作用機制清晰呈現，而這恰好與中藥復方的復雜及不確定性相吻合。本研究通過分子對接與網絡藥理學技術發掘預測并優選SH有效成分及其作用靶點，構建可視化“成分-靶點-疾病-通路”多層次、多維度網絡圖，明確其藥效物質基礎，深入探究其治病機制，闡明其靶點作用通路，為SH后續的處方優化及藥效學評價提供參考。同時也為其他復方中藥的研究提供思路與方法，使其提高實驗工作效率，促進現代中醫藥發展及新藥的發現與創新[33-35]。

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（2020-07-22收稿 本文編輯：魏慶雙）0C78C04D-8860-4BF5-ABFB-98B024AB37B0