基于網絡藥理學對半夏治療肺結核作用的研究

何彩林 石廷玉

[摘要]目的 基于網絡藥理學初步探討半夏治療肺結核的活性成分、靶點及作用通路，為深入探討半夏治療肺結核的作用機制提供理論依據。方法 借助TCMSP數據庫檢索半夏的活性成分及潛在作用靶點;通過GeneCards、OMIM數據庫得出肺結核相關作用靶點;運用Venny2.1軟件制作藥物靶點與疾病靶點韋恩圖;利用Cytoscape3.7.2軟件及STRING數據庫繪制藥物與疾病共同靶蛋白相互作用（PPI）網絡及中藥-成分-疾病-靶點相互作用網絡;采用Metascape數據庫及bioinformatics軟件對藥物與疾病共同靶點進行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析;并通過Cytoscape3.7.2軟件繪制成分-靶點-通路網絡。結果經過篩選，半夏作用于肺結核主要通過黃芩素、卡維丁、β-豆甾醇、豆甾醇等有效成分，AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因，以及癌癥信號通路和TB通路。結論初步預測獲得半夏有效成分抗結核作用機制，相關活性成分與關鍵靶點以及作用通路的結合可能是其治療肺結核的機制之一。

[關鍵詞]半夏;肺結核;活性成分;關鍵靶點;網絡藥理學

[中圖分類號]R978.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]2095-0616（2022）12-0020-05

肺結核（pulmonary tuberculosis，PTB）是一種傳染性疾病，其癥狀有慢性咳痰、咯血、盜汗、疲勞和體重減輕;肺外表現包括淋巴結炎，腎臟、骨骼或關節受累，腦膜炎或播散性疾病[1]?？人栽诓≡w結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）的傳播中起關鍵作用[2]。痰中的MTB是主要傳播來源，因此其為全球結核?。╰uberculosis，TB）控制策略的重點[1]。據估計，世界上約有1/4的人口患有潛伏性結核病，其中5%～10%的感染者會發展為活動性結核病[3]。TB致死率位列傳染病第一，且耐藥性結核分枝桿菌（drug resistance mycobacterium tuberculosis，MDR-TB）的出現加劇問題的嚴重性[4-5]。MDR-TB對實現世界衛生組織（WHO）到2030年終結結核病戰略的全球目標構成威脅[6-7]。因此，迫切需要新的有效藥物來應對PTB。

《名醫別錄》載“半夏，......主消心腹胸中膈痰熱滿結，咳嗽上氣”，具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結的功效[8];化學成分有生物堿類、有機酸類、揮發油類、蛋白質類、黃酮類、糖類、氨基酸類、無機元素類及苯酚類等，有止咳、祛痰、抗腫瘤、鎮痛、抗炎、維持免疫力的作用[9]。目前，半夏在治療PTB方面機制研究較少，本研究擬通過網絡藥理學的方法探討半夏治療PTB的作用機制，以期為今后臨床應用和研究提供新思路。

1資料與方法

1.1半夏活性成分篩選及潛在靶點預測

在TCMSP數據庫篩選半夏活性成分，用Uniprot數據庫篩選活性成分對應的作用靶基因[10]。

1.2肺結核靶點及“藥物-疾病”共同靶點采集

通過GeneCards數據庫和OMIM數據庫搜索，輸入關鍵詞“pulmonary tuberculosis”，獲得疾病靶點[11]。應用Venny2.1在線工具繪制韋恩圖。獲得半夏與PTB共同基因靶點。

1.3“疾病-藥物-活性成分-靶點”網絡的構建

將化合物-靶點和疾病-靶點的相關數據導入Cytoscape3.7.2中進行整合，生成疾病-藥物-活性成分-靶點的網絡關系圖[12]。

1.4蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建

將共同靶點基因傳至STRING數據庫中，其物種為“HomoSapiens”，去除離散的點，將數據導入Cytoscape3.7.2構建半夏的PPI網絡圖[13]。

1.5基因本體論（gene ontology，GO）生物功能和京都基因與基因組百科全書（Kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將半夏與PTB交集基因傳至Metascape數據庫[14]，進行基因的GO生物功能和KEGG通路富集分析。根據P<0.05表示該富集結果具有顯著性;P值越小，其顯著性越高。并借助bioinformatics對結果可視化。

1.6構建“成分-靶點-信號通路”結構圖

參照Metascape數據庫中KEGG富集通路信息，設定P<0.05，篩選靠前的20條通路進行整合，將核心靶點與信號通路上富集的靶點相互匹配，取其交集得到交集靶點，交集靶點與成分匹配后制作文檔。最后導入Cytoscape3.7.2繪制“成分-靶點-信號通路”結構圖[15]。

2結果

2.1中藥活性成分及對應靶點篩選結果

通過TCMSP數據庫檢索半夏化學成分，并以OB≥30%和DL≥0.18為篩選條件，再在UniProt數據庫中找出化學成分對應的靶基因名稱，物種限定為“Homo Sapiens”，獲得13個潛在活性成分，76個靶點。

2.2“藥物-疾病”共同靶點采集

通過GeneCards數據庫和OMIM數據庫搜索，輸入關鍵詞“pulmonary tuberculosis”，匯總去重后獲得PTB靶點1068個。將藥物靶點與疾病靶點對應，應用Venny2.1在線工具繪制韋恩圖（圖1）。通過繪制韋恩圖獲得半夏與PTB的共同基因靶點29個。

將半夏的活性成分及作用靶點輸入Cytoscape3.7.2，構建活性成分-作用靶點網絡圖（圖2）。

2.4PPI網絡圖構建

將藥物和疾病相映射得到的29個交集基因在STRING平臺進行PPI網絡分析，去除孤立點，將數據導入Cytoscape3.7.2得到PPI網絡（圖3），顯示AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN連接度值顯著高于其余靶點，AKT1的節點最大，可能是半夏治療PTB最主要的潛在靶點。

2.5GO和KEGG分析

GO生物功能富集分析，主要包括生物過程、分子功能、細胞成分。共獲得P值小于0.05的GO功能條目376條，其中生物過程包括對無機物的反應、細胞凋亡信號通路、氧化應激等604條，細胞組分包括轉錄調控復合物、RNA聚合酶II轉錄調控復合物、細胞器外膜等15條。分子功能包括蛋白體的活動、蛋白域特異性結合、轉錄因子結合等47條。根據P值前20條信號通路進行KEGG富集分析并繪制氣泡圖（圖4），結果顯示，其顯著富集在癌癥信號通路（pathways in cancer）、TB、乙型肝炎（hepatitisB）、細胞凋亡（apoptosis）和麻疹（measles）等信號通路。

用29個核心靶點和KEGG根據P值得到的前20條信號通路，導入CytoScape3.7.2軟件創建“活性成分-靶點-通路”網絡圖（圖5）。反映出黃芩素、卡維丁、松柏素、β-豆甾醇、豆甾醇5個成分最為重要。

3結論

在TB中咳嗽既是一種癥狀，也是一種疾病傳播方式，人類的先天咳嗽反射和后天咳嗽行為可能受到MTB和TB的影響[2]?！妒幧駮酚涊d半夏用來治療咳嗽痰多[16]。研究發現半夏中生物堿有鎮咳作用，其總游離有機酸能夠鎮咳祛痰[17]。本研究運用網絡藥理學方法，以PTB為目標疾病，篩選半夏抗結核的作用靶點、活性成分以及相關通路。預測的作用靶點中AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因可能是半夏治療PTB的主要靶點。通過分析發現，半夏活性成分中有5個成分可能具有抗結核效果，其中黃芩素、卡維丁、松柏素、β-豆甾醇、豆甾醇等成分對應的相關靶點個數較多，提示這些成分可能是半夏發揮作用的重要成分，并為半夏抗結核作用提供了理論依據。

PTB涉及多種病理過程如纖維化、肺炎、肝臟疾病等[18]。另外，有研究表明PTB和肺癌具有相關性[19]。AKT1的抑制可誘導吞噬體成熟為吞噬溶酶體，從而殺死細胞內細菌，與PTB易感性有關，因此，AKT1抑制劑有望作為抗生素用于治療TB，尤其是MDR-TB[20]。TP53基因的突變是包括肺癌在內的人類癌癥中檢測到的五種突變之一，其在肺上皮細胞的致癌轉化和肺癌進展中都起著重要作用，TP53的高突變率使其基因改變成為非常有吸引力的潛在治療靶點[21-22]。研究發現，VEGFA的高表達為MTB的持續存在創造了最舒適的條件，因此，可使用針對VEGFA阻斷的靶向治療[23]。PPARG的上調已被證明會增加幾種人類癌癥的化學敏感性[24]。纖維化通常發生在TB治療期間，研究表明黃芩素可抑制不同組織器官纖維化的發生和發展，且有望被批準為特定的抗纖維化藥物[25-26]。因此，黃芩素作為抗結核藥物還可以改善或治療PTB導致的纖維化、肺癌等癥狀。

綜上所述，半夏主要通過黃芩素、卡維丁、β-豆甾醇、豆甾醇等有效成分，AKT1、TP53、VEGFA、PPARG、JUN等靶點基因，以及癌癥信號通路和TB通路等發揮抗結核作用。本研究為今后更深一步探索半夏抗結核活性成分治療PTB的作用機制奠定了理論基礎并提供了有益的思路。

[參考文獻]

[1] Acharya B，Acharya A，Gautam S，et al.Advances in diagnosis of Tuberculosis： an update into molecular diagnosis of Mycobacterium tuberculosis[J].Mol Biol Rep，2020，47（5）：4065-4075.

[2] Turner RD.Cough in pulmonary tuberculosis： Existing knowledge and general insights[J].Pulm Pharmacol Ther， 2019，55：89-94.

[3] Jeon D.Latent tuberculosis infection： recent progress and challenges in South Korea[J].Korean J Intern Med， 2020，35（2）：269-275.

[4]陳曉博，李俊.抗結核藥物靶點的結構研究進展[J].自然雜志，2021，43（5）：335-342.

[5] Fatima S，Kumari A，Das G，et al.Tuberculosis vaccine： A journey from BCG to present[J].Life Sci， 2020，252：117594.

[6] Guo Z，Xiao D，Wang X，et al.Epidemiological characteristics of pulmonary tuberculosis in mainland China from 2004 to 2015： a model-based analysis[J]. BMC Public Health，2019，19（1）：219.

[7] Cocozza AM，Linh NN，Jaramillo E.Is effective patient support missing in the global response to multidrug- resistant tuberculosis？[J].Int J Tuberc Lung Dis，2020， 24（6）：626-630.

[8]魏康康，杜金行，常江夢，等.仲景半夏用法初探[J].天津中醫藥大學學報，2020，39（2）：155-157.

[9]王恒，于淼，李偉楠，等.半夏化學成分及抗腫瘤作用機制研究進展[J].中醫藥導報，2021，27（8）：49-52.

[10]王康，孟泳，王玉潔，等.蒼耳子治療過敏性鼻炎的分子機制研究[J].轉化醫學雜志，2021，10（5）：330-334.

[11]劉艷霞，任明輝，杜寶中.基于網絡藥理學的白頭翁治療肺結核作用機制研究[J].中國當代醫藥，2021，28（27）：4-9.

[12]張海東，曲妮妮.基于網絡藥理學分析七味都氣丸治療慢性阻塞性肺疾病的作用機制[J].現代中西醫結合雜志，2021，30（32）：3594-3601.

[13]劉莉，王鳳云，王卓，等.基于網絡藥理學探討貓爪草異病同治的作用機制[J].廣東藥科大學學報，2021，37（5）：78-84.

[14]王佳俊，陳青垚，王建，等.基于數據挖掘和網絡藥理學探究含黃連方劑治療潰瘍性結腸炎的配伍規律及作用機制[J].中草藥，2021，52（19）：5984-5995.

[15]張愿，謝紅艷，田苑，等.基于網絡藥理學探討穿心蓮治療新型冠狀病毒肺炎機制研究[J].四川中醫，2021，39（9）：56-61.

[16]陳修園，趙正山.十藥神書注解[M].福州：福建科學技術出版社，1982：18-25.

[17]鄭冬寧，趙朝旭，江瑩，等.半夏藥材質量標準研究進展[J].大眾標準化，2021（24）：13-15.

[18] Kang W，Du J，Yang S，et al.The prevalence and risks of major comorbidities among inpatients with pulmonary tuberculosis in China from a gender and age perspective： a large-scale multicenter observational study[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2021，40（4）：787-800.

[19] Molina-RomeroC，ArrietaO，Hernández-PandoR. Tuberculosis and lung cancer[J].Salud Publica Mex， 2019，61（3）：286-291.

[20] Wang X，Cao Z，Jiang J，et al.AKT1 polymorphisms are associated with tuberculosis in the Chinese population[J]. Int J Immunogenet，2010，37（2）：97-101.

[21] Smardova J，Liskova K，Ravcukova B，et al.Complex analysis of the p53 tumor suppressor in lung carcinoma[J]. Oncol Rep，2016，35（3）：1859-1867.

[22] Long J，Wang A，Bai Y，et al.Development and validation of a TP53-associated immune prognostic model for hepatocellular carcinoma[J].EBioMedicine，2019，42：363-374.

[23] Golubinskaya EP，Filonenko TG，Kramar TV，et al. Dysregulation of VEGF-dependent angiogenesis in cavernous lung tuberculosis[J].Pathophysiology， 2019，26（3-4）：381-387.

[24] Lian M，Chen J，Shen X，et al.Pparg may Promote Chemosensitivity of Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma[J].PPAR Res，2020，2020：6452182.

[25] Evans S，Butler JR，Mattila JT，et al.Systems biology predicts that fibrosis in tuberculous granulomas may arise through macrophage-to-myofibroblast transformation[J]. PLoS Comput Biol，2020，16（12）：e1008520.

[26]朱慶均.黃芩苷與黃芩素治療纖維化疾病研究進展[J].中國中藥雜志，2017，42（7）：1271-1276.

（收稿日期：2022-01-10）