高原低氧對小鼠體內丙戊酸鈉腦血分布的影響

胡 琳，趙安鵬,秦寧寧，馬江紅，申亦可，謝 華, 李文斌，王 榮,

(1. 蘭州大學藥學院, 甘肅 蘭州 730000；2.聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科, 甘肅 蘭州 730050)

丙戊酸鈉是目前癲癇治療的一線推薦藥物，對各種類型癲癇有效，應用廣泛，但是其治療窗窄，近期發現對血液系統和中樞神經系統有一些不良反應，例如高血氨癥和認知功能障礙等[1]。臨床上通過治療藥物監測尋找最佳用藥劑量，使患者的血藥濃度處于治療窗內，從而間接控制藥物入靶器官即大腦的藥物濃度。中樞神經藥物需通過血腦屏障進入腦組織發揮藥效。狹義的血腦屏障 (blood brain barrier，BBB)[2]是指將中樞神經系統和外周循環系統分開的由微血管內皮細胞、星形膠質細胞、基底膜以及與附在內皮細胞的周細胞和神經元組成多細胞血管結構，它通過調節外周與中樞神經系統之間的分子交換來維持中樞神經系統的動態平衡。當血腦屏障對藥物的通透性發生改變時，治療藥物監測獲得的血藥濃度則可能無法正確反映腦內藥物濃度，對藥物治療的安全性、有效性帶來潛在的危害[3]。Dagan等[4]研究表明，簡單地使用血藥濃度作為中樞神經系統中藥物濃度的替代標志物可能會導致劑量不足。藥物透過血腦屏障的程度除取決于藥物自身的性質外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉運蛋白的含量與功能也是重要的因素[5]。課題組前期研究表明，高原低氧會不同程度改變血腦屏障中藥物轉運蛋白的表達[6-7]。丙戊酸鈉作為BBB中藥物轉運外排泵P-gp的底物[8]，在高原低氧環境下，其血腦透過率是否會發生改變？本研究對高原低氧環境下丙戊酸鈉的血藥濃度及入腦丙藥物濃度進行分析，并研究缺氧對血腦屏障上藥物轉運蛋白P-gp表達的影響，旨為高原丙戊酸鈉合理用藥提供依據。

1 材料

1.1 主要藥品與試劑丙戊酸鈉對照品(批號100963-202004)、替米沙坦對照品(批號100629-200401)和丙戊酸鈉(批號Y18J7C16394)分別購自中國食品藥品檢定研究院和上海源葉生物技術有限公司；色譜純乙腈(批號JA107230)購自德國MERCK公司；乙酸銨(批號H2110077)、伊文斯藍(批號1922129)購自aladdin；葡聚糖(70 ku，批號C1755925)購自Merck millipore；細胞濾網(40 μm、100 μm)購自biosharp；山羊抗兔IgG-HRP二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；Anti-P Glycoprotein antibody (ab170904)和Anti-Atp1a1 antibody (ab76020) 購自美國Abcam公司。

1.2 主要儀器UFLC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；API3200三重四級桿串聯質譜儀(美國應用生物系統公司)；Spectra Max i3酶標儀(美國Molecula公司)；蛋白免疫印跡電泳儀(美國Bio-Rad)；Chemi DOCTMMP Imaging System(美國BIO-RAD公司)等。

1.3 實驗動物♂昆明小鼠，SPF級，體質量18～22 g，由斯貝福生物技術有限公司提供，實驗動物許可證：SCXK(京)2019-0010。動物實驗經蘭州聯勤保障部隊第九四〇醫院倫理委員會批準且實驗均按照相關指導原則和規定進行，審批編號：2021KYLL190。

2 方法

2.1 動物分組及急進方式將♂昆明小鼠隨機分為對照組(甘肅蘭州，海拔1 500 m)和高原低氧組(青海玉樹巴塘，海拔4 010 m)。對照組小鼠(分為P1、 P2、P3、P4，共4組)在蘭州禁食12 h后開始實驗；高原低氧組小鼠(分為H1、H2、H3、H4，共4組)航空及公路托運至青海玉樹巴塘，禁食12 h后開始實驗。其中P1、H1組用于灌胃給藥，P2、H2組用于靜脈注射給藥，P3、H3組提取血腦屏障，P4組、H4組用于評價血腦屏障通透性。

2.2 樣品收集P1組和H1組小鼠(每組36只)灌胃給予 (i.g.) 136.5 mg·kg-1的丙戊酸鈉(小鼠給藥劑量由人體給藥劑量15 mg·kg-1通過體表面積換算獲得)，并于給藥第5、10、30、60、120、240 min時分別取6只小鼠取血，兩組共72只；P2組和H2組小鼠(每組60只)尾靜脈注射 (i.v.) 相同劑量的丙戊酸鈉，給藥后第2、5、30、60、120、240 min時分別取10只小鼠取血，兩組共120只，1 000×g離心5 min，取上層血漿-80 ℃保存。上述小鼠取血后立即處死，取大腦并用生理鹽水洗凈，-80℃保存。

2.3 色譜質譜條件Gemini C18 (3.0 mm×75 mm, 3.0 μm)色譜柱，流動相為乙腈-2 mmol·L-1乙酸銨溶液 (85 ∶15,V/V)；柱溫：25 ℃，流速：0.4 mL·min-1，進樣量：2 μL，分析時間為3 min。在ESI源負離子電離方式下，采用多反應監測模式 (MRM)有較好的質譜響應，質譜參數設置如下：噴霧電壓 (IS)為-4 500 V，霧化溫度 (TEM)為400 ℃，丙戊酸鈉和替米沙坦碰撞誘導解離電壓 (DP)分別為-30 psi、-15 psi，碰撞能量 (CE)為-5 psi、-19 psi。丙戊酸鈉、替米沙坦檢測離子分別為m/z 142.6→142.6、m/z 513.2→469.2。

2.4 生物樣品處理方法準確吸取血漿樣品10 μL置于0.5 mL的EP管中，加入40 μL大鼠空白血漿，再加入200 μL的5 mg·L-1內標溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清于進樣瓶中，進樣量2 μL。取備用腦組織，稱取0.1 g腦皮層于2 mL的EP管中，加1.0 mL生理鹽水勻漿，取25 μL勻漿液再加入175 μL的5 mg·L-1內標對照品工作溶液，渦旋震蕩30 s，4 500×g離心10 min后取上清液進樣。

2.5 血腦屏障提取P3組和H3組(每組10只)小鼠處死后，立即取出大腦。大腦在冰冷的Hank’s溶液中剝去軟腦膜，再去除大血管和髓質。剩余組織在Hank’s溶液使用玻璃勻漿器上下勻漿6次，勻漿液于1 000×g離心10 min。沉淀重懸于15 mL 18%葡聚糖中，然后在4 500×g離心15 min。沉淀重懸于Hank’s溶液，懸浮液先后用100 μm細胞濾網和40 μm細胞濾網過濾。隨后用含有2%蛋白酶抑制劑的Hank’s溶液收集濾網上的腦微血管，4 500×g離心15 min后收集的沉淀即為腦微血管[9]。采用膜提取試劑盒提取腦微血管的膜蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。

2.6 血腦屏障通透性評價P4組和H4組小鼠(每組6只)尾靜脈注射 (i.v.)2%伊文斯藍溶液 (2 mL·kg-1),循環45 min后迅速取出全腦用濾紙吸凈。右半球腦組織在3 mL甲酰胺中剪碎后，60 ℃水浴孵育24 h，4 500×g離心5 min。在610 nm處，測量伊文思藍含量。并根據標準曲線定量，結果表示為(μg伊文思藍染色)/(g組織)。

2.7 P-gp蛋白的定量通過7%SDS-PAGE分離蛋白樣品，并在恒定電壓80 V下轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗anti-P-gp antibody, anti-ATP1a1 antibody 4 ℃過夜孵育。隨后用TBST洗4次后，室溫孵育二抗后，PVDF膜用TBST洗4次后，進行曝光。

2.8 數據處理腦/血藥物濃度比值=腦組織藥物濃度(μg·g-1) /血漿藥物濃度(mg·L-1)，即K(brain/plasma)=C (brain)/C (plasma)[10]；曝光圖片通過ImageJ軟件分析目的蛋白表達量。實驗結果采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 方法驗證

3.1.1專屬性 取空白血漿、空白腦組織、空白血漿加丙戊酸鈉、空白腦組織加丙戊酸鈉及給藥后的小鼠生物樣品，按照“1.4.2”方法處理進樣,丙戊酸及內標替米沙坦的典型色譜圖見Fig 1，從圖可知該方法對丙戊酸鈉和內標替米沙坦的專屬性良好，腦組織及血漿中內源性物質不干擾色譜分析，滿足定量要求。

Fig 1 Chromatograms of sodium valproate in biological samplesA，B: Blank plasma and blank brain, C，D: Blank plasma and blank brain spiked with standard sodium valproate, E-F: Sample of plasma and brain, Blue: Sodium valproate; Red: IS.

3.1.2線性范圍 丙戊酸在血漿和腦組織中線性范圍為0.05～100 mg·L-1，得到的線性回歸方程為:Y=0.001 51X+4.49(r=0.997 4)；Y=0.013 1X+0.598 6(r=0.999 6)，結果表明待測物在設定濃度范圍內具有良好的線性。

3.1.3精密度與準確度 結果見Tab 1，丙戊酸鈉的日內和日間精密度和準確度均滿足生物樣品測定要求。

Tab 1 Accuracy and precision of sodium

3.1.4基質效應和提取回收率 丙戊酸鈉滿足定量要求，并且不存在明顯的生物樣品基質效應。

3.1.5穩定性 丙戊酸鈉生物樣品在4 ℃保存24 h、3次反復凍融、-80 ℃保存一個月的穩定性。結果表明：在不同條件處理后，丙戊酸鈉生物樣品中濃度變化≤8.87%，表明具有良好的穩定性。

3.2 生物樣品中藥物濃度的測定結果

3.2.1灌胃給藥的樣品藥物濃度 小鼠灌胃給藥丙戊酸鈉后，第5、10、30、60、120、240 min時血漿及腦組織中丙戊酸鈉分布見Fig 2。與對照組相比，給藥第30、60 min時高原組血藥濃度分別降低了35.77%、33.7%；高原組腦組織中藥物濃度高于對照組，其中給藥第60、120 min時高原腦組織藥物濃度分別升高了148.3%、172.0%；高原組腦/血藥物濃度比值在第10、30、60、120 min時分別增加44.0%、57.9%、176.8%、184.5%。

Fig 2 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice by intragastric administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/blood ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P1

3.2.2尾靜脈注射給藥的樣品藥物濃度 小鼠尾靜脈注射丙戊酸鈉第2、5、30、60、120、240 min時，血漿及腦組織中丙戊酸鈉藥物濃度見下Fig 3。由圖可知，與對照組相比，當血藥濃度值相差不大時，高原組腦皮層中藥物濃度在各個時間點均高于對照組，且在第60 min時濃度增大27.4%，在第120 min時增大62.4%，在第240 min時增大45.8%。與對照組相比，高原組腦/血藥物濃度比值在第60、120、240 min時分別增加了33.9%、50.6%、125.6%。

Fig 3 Concentrations and brain/plasma ratio of 136.5 mg·kg-1 sodium valproate in mice injected intravenously administration(n=6)A: Plasma, B: Brain,C: Brain/plasma ratio *P<0.05,**P<0.01 vs P2

3.3 血腦屏障完整性評價對照組與高原組小鼠腦組織中伊文斯藍含量分別 (3.65±0.88) μg·g-1和 (3.67±0.76) μg·g-1，差異無統計學意義(P>0.05)，表明血腦屏障的完整性無明顯改變。

3.4 高原低氧對小鼠血腦屏障中P-gp表達的影響通過Western blot對腦微血管段中ABC族藥物轉運蛋白P-gp進行定量，在分子量為170 ku處檢測到特異性條帶。如Fig 4，與對照組相比，高原組P-gp蛋白相對表達量明顯下降了58.5% (P<0.05)。

Fig 4 Influence of altitude hypoxia environment (4010 m ) on P-gp protein expression level in blood brain barrier *P<0.05 vs P3

4 討論

癲癇患者不能被徹底治愈，需終身用藥。研究發現長期或高劑量服用丙戊酸鈉的患者會發生一系列不良反應，例如神經毒性[1]。高原低氧環境會不同程度改變血腦屏障中藥物轉運蛋白的表達，所以研究高原低氧對丙戊酸鈉入腦的影響十分必要。本研究通過灌胃和注射兩種給藥方式研究高原低氧對丙戊酸鈉的血腦屏障透過率的影響。結果表明，丙戊酸在高原組的血腦屏障透過率均高于對照組。除藥物自身性質外，血腦屏障完整程度及血腦屏障中藥物轉運蛋白的含量與功能也是影響藥物血腦屏障透過率的重要因素。

在研究高原低氧對丙戊酸鈉腦組織分布影響之前，我們首先使用伊文斯藍對血腦屏障進行完整性評價。伊文斯藍可與白蛋白(血漿中分子量最小的蛋白之一)形成復合體，若血腦屏障完整性受到破壞，復合體會遷移到腦組織中。根據腦組織中伊文斯藍的含量可判斷血腦屏障的完整性。伊文斯藍結果表明，高原組與對照組腦內伊文思藍含量無顯著性差異，表明本研究所采用的高原低氧條件對小鼠的血腦屏障完整性無明顯影響，這與前期課題組結果相同[11]。許多耐藥性癲癇患者對多種抗癲癇藥表現出耐藥性，這些患者血藥濃度在有效范圍值內時，卻沒有達到抗癲癇效果[12]，研究發現這可能是由于腦區域中P-gp和其他外排轉運體高表達的原因。P-糖蛋白 (P-gp)是一種外排轉運蛋白，在小鼠腦微血管管腔表面表達，其可將進入血管內皮細胞的部分底物藥物再次排向血液(即管腔側)，從而減少藥物向腦組織的分布，研究表明減少BBB處P-gp的表達或抑制其功能會導致腦內藥物濃度增加[13]。大多數抗癲癇藥是P-gp的底物。通過對所提取的小鼠腦微血管的P-gp進行定量發現，高原低氧環境下小鼠腦微血管的P-gp表達量下降，這可能是高原組丙戊酸鈉腦血透過率高于對照組的原因。因為P-gp是外排轉運蛋白，其低表達量可能會使腦內丙戊酸鈉外排減少。

總之，本研究發現高原低氧環境增加了丙戊酸在小鼠血腦屏障上的透過程度，從而改變了丙戊酸在小鼠體內的腦血分布，這可能與高原低氧環境下調了小鼠腦微血管上P-gp的表達量有關，這為高原癲癇患者合理用藥提供依據。