黃麻組培再生體系的研究

方平平，王建勇，祁建民，陶愛芬，徐建堂，張立武

（1.福建農林大學農學院作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室／福建省作物設計育種重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建農林大學農業農村部東南黃紅麻實驗觀測站／福建省麻類種質資源共享平臺／福建省南方經濟作物遺傳育種與多用途開發國際科技合作基地，福建 福州 350002；3.福建農林大學海峽聯合研究院基因組與生物技術中心，福建 福州 350002）

黃麻是世界上種植規模僅次于棉花的重要纖維作物，其生產主要分布在亞洲的印度、孟加拉國等，是這些國家重要的經濟作物。其主要的栽培品種有：“圓果種”（Corchorus capsularis L.）和“長果種”（Corchorus olitorius L.）。黃麻具有纖維產量高、質地柔軟、吸濕性能好等諸多優點，廣泛應用于商業、工業和建筑業領域。

植物組織培養經過百余年的發展，已經成為生物科學中一項不可或缺的技術，其對作物育種與遺傳轉化有重要的意義[1]。而構建植物組織的再生體系，尤其是植物愈傷組織的獲得，更是原生質體融合、遺傳轉化、植株再生等的研究基礎[2-3]。目前，國內外有關黃麻再生體系的研究報道較少，且多采用子葉和下胚軸作為離體培養的材料，同時存在愈傷組織易褐化，不定芽再生困難等問題[4-5]。目前已建立的黃麻再生體系的通用性仍然較差，建立穩定的黃麻再生體系十分必要。

本研究以不同基因型的黃麻幼莖為外植體，研究不同濃度的激素配比對黃麻愈傷組織的誘導，以及愈傷組織分化不定芽、不定根的差異，建立不同品種黃麻品種的再生體系，以期為進一步利用原生質體融合和遺傳轉化技術對黃麻種質資源進行改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗種子為2份圓果種黃麻“梅峰4號”（以下稱M4）、“179”，以及2份長果種黃麻“尤溪長果”（以下稱YC）、“廣巴矮”（以下稱GBA），均由福建農林大學麻類作物遺傳育種與綜合利用實驗室提供。

1.2 儀器與試劑

儀器與設備：超凈工作臺、冰箱、光照培養箱、微波爐、高壓蒸汽滅菌鍋、烘干箱、pH計；

藥品與試劑：無水乙醇、工業酒精、蒸餾水、次氯酸鈉、氫氧化鈉、蔗糖、瓊脂粉等；

植物激素：噻苯?。═DZ）、2.4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、抗壞血酸（Vc）、吲哚丁酸（IBA）。

MS培養基見表1。

表1 MS培養基配方Table 1 MS formula

1.3 試驗方法

1.3.1 黃麻無菌苗的獲得

4個黃麻品種均選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用純凈水清洗半小時后晾干，備用。

（1）滅菌處理篩選

按照文獻[6]的方法，在超凈工作臺上將準備好的黃麻種子進行滅菌處理，而后接種于3種MS培養基。3種培養基的配制方法參考文獻[8-9]。

（2）培養條件

接種后，培養基置于光照培養箱，處理條件：光／暗交替16 h／8 h，溫度25℃／20℃（白天／黑夜），光照強度為 2000 YC[6]。

1.3.2 愈傷組織的誘導

培養15 d后，取無菌苗莖段，接種于MS培養基（不同激素配方）。15 d轉接一次，40 d進行愈傷組織的誘導情況統計。每個激素組合處理20個莖段，4次重復。采用均勻設計法培養[7]（表2）。

表2 愈傷組織誘導試驗均勻設計表Table 2 The uniform design table on callus induction

1.3.3 不定芽誘導

按表3的方案設計不定芽誘導MS培養基，愈傷組織切成小塊，置于不同的培養基中，每個激素組合處理20個莖段，4次重復[6]。30 d后統計分化率，40 d后統計不定芽誘導率。

表3 不定芽誘導試驗正交設計表Table 3 The orthogonal experimental design table on induction of adventitious buds

1.3.4 不定根誘導

取4～5 cm不定芽，置于不同激素組合的不定根誘導培養基中（表4），每個激素組合處理20個不定芽，4次重復[6]，30 d統計生根率。

表4 不定根誘導培養基試驗正交設計表Table 4 The orthogonal experimental design table on induction of adventitious roots

1.3.5 再生苗移栽

黃麻再生根3～4 cm時，煉苗處理。3 d后，移栽花盆煉苗。一個月后，移栽大田觀察。

1.4 數據處理

試驗數據通過excel進行方差分析和多重比較；采用SPSS軟件對不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導結果進行回歸分析，以得出最優激素組合。

2 結果與分析

2.1 預處理結果分析

2.1.1 次氯酸鈉處理

設置6種不同時間的次氯酸鈉處理，考察其對黃麻種子發芽率和污染率的影響，結果表明（表5），次氯酸鈉處理對不同黃麻品種的萌發率和污染率有極顯著影響。所有品種的黃麻種子發芽率整體上均隨處理時間增加而上升，處理20～30 min時，發芽率達到最大，而后隨著處理時間增加，發芽率開始下降；種子污染率則隨處理時間增加而下降。

表5 次氯酸鈉處理對黃麻發芽率與污染率的影響Table 5 Effect of sodium hypochlorite treatments on jute seeds germination

綜合考慮污染率與發芽率，次氯酸鈉處理的最佳時間為：黃麻179和梅峰4號20 min，廣巴矮和尤溪長果為30 min。

2.1.2 不同培養基處理

設計3種不同培養基，考察其對黃麻種子發芽率和污染率的影響，結果表明（表6），不同培養基對黃麻品種的影響差異較大。在3種培養基上，梅峰4號和179的發芽率均在89%以上，污染率10%左右，差異不明顯。而長果種黃麻種子的發芽率和污染率卻差異顯著，2個長果種黃麻品種在MS（s-）培養基中的發芽率明顯高于其他兩種培養基，而污染率明顯低于其他兩種培養基。

表6 不同培養基對黃麻發芽的影響Table 6 The effect of different media on jute germination

綜上，圓果種黃麻可采用普通的MS培養基，而長果種黃麻則以MS（s-）培養基為佳。

2.2 愈傷組織誘導

采用均勻設計法進行愈傷組織誘導培養基激素組合試驗，該方法通過少量組合，即可篩選出最優解，并確定出回歸方程。結果表明，4種黃麻愈傷組織的誘導率差異明顯（表7）。其中，在設定的激素組合中誘導，179的最高誘導率為90%，M4為70%，而長果種黃麻YC和GBA最高誘導率分別為45%和42%，其誘導效果為：179＞M4＞YC＞GBA。

表7 不同激素組合對黃麻愈傷組織的誘導結果Table 7 The effect of different hormone combinations on callus induction of jute

（1）179：采用SPSS軟件對黃麻179的數據進行回歸分析，以Y代表誘導率，X1代表TDZ，X2代表2，4-D，X3代表6-BA，X4代表 NA，X5代表 VC，得到回歸方程：Y＝0.71＋0.39X12-0.77X1X2-0.17 X1X3-0.02X1X4＋0.28X22＋0.2X2X3＋α。說明4種激素對黃麻179愈傷組織的誘導率具有顯著影響，而VC則無顯著影響。

上述回歸方程中的α為隨機誤差項，對回歸方程求解最大值，得到X1＝0，X2＝0.53，X3＝2，X4＝0。為驗證該方程，將黃麻179莖段接種到 MS＋0.53 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L 6-BA培養基中進行誘導，接種15 d后，愈傷組織誘導率為100%，由此得出該培養基激素組合即為黃麻179的最佳愈傷組織誘導培養基。

（2）梅峰 4號：方法同黃麻179。獲得最優誘導培養基為 MS＋2.0mg／L TDZ＋0.5mg／L 2，4-D，最大誘導率為100%。

（3）尤溪長果：方法同黃麻179。獲得最優誘導培養基為MS＋2.0 mg／L TDZ＋2.0 mg／L 6-BA，最大誘導率為63%。

（4）廣巴矮：方法同黃麻179。獲得最優愈傷組織誘導培養基為：MS＋2.0 mg／L TDZ＋2.0 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L 6-BA，最大誘導率為52%。

從愈傷組織誘導率的結果分析，圓果種黃麻的誘導率顯著高于長果種黃麻。

圖1 不同黃麻品種的愈傷組織Fig.1 The induction callus of 4 varieties of jute

2.3 不同溫度處理

試驗表明，培養溫度為27℃時，4個黃麻品種愈傷組織的初代和二代培養均可快速增殖，且褐化程度低，但從第三代培養開始，褐化率明顯提高。為此，設置不同溫度處理進行第三代愈傷組織培養，統計其愈傷組織的增長量和未褐化比率。結果表明（圖2），4種黃麻愈傷組織的增殖速度均隨溫度的升高而升高，但褐化率也隨之升高。不同溫度處理對愈傷組織褐化率具有顯著影響（表8）。溫度為21℃時，4種黃麻愈傷組織的增殖量都在0.1～0.5 g，但褐化率小于等于30%。而溫度為27℃時，增殖量都在0.9 g以上，但褐化率高達62%～70%。綜合愈傷組織的增殖量和褐化情況，確定黃麻的第三代愈傷組織在23℃培養。

圖2 不同溫度對黃麻愈傷組織的影響Fig.2 Effects of different temperatures on jute callus

表8 不同溫度對黃麻愈傷組織褐化率的影響Table 8 Effects of different temperatures on browning rate of jute callus

2.4 不定芽誘導

按照正交設計，配制了12組不定芽誘導MS培養基，方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在極顯著差異（表9）。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定芽誘導率明顯優于長果種黃麻。其誘導效果排序為：179＞M4＞YC＞GBA。從激素組合差異分析，4個品種愈傷組織不定芽誘導率均呈現先升后降的趨勢（圖3）。在9號培養基中誘導分化，每個品種均表現為最高的不定芽誘導率，黃麻179為35.0%，梅峰4號30%，尤溪長果22.6%，廣巴矮15%。

表9 黃麻愈傷組織不定芽誘導率的方差分析Table 9 Varianceanalysis on jute callus induction rate of adventitious buds

圖3 不同激素組合對黃麻不定芽的誘導結果Fig.3 The effect of induction of adventitious roots on different hormone combinations

從分化的表型分析，愈傷組織前期形成顆粒狀的生長點，中期繼續生長的同時，褐化嚴重，后期僅少數生長點能長出健康的不定芽（圖4）。而長果種黃麻廣巴矮誘導出的不定芽隨著愈傷組織褐化的加劇而全部死亡。

圖4 誘導的黃麻不定芽Fig.4 The adventitious buds of jute

2.5 不定根誘導

按照正交設計，配制了16組不定根誘導培養基，由于GBA的不定芽全部衰亡，因此，僅將分化出健康不定芽的3個黃麻品種接種到生根培養基上。方差分析表明，基因型間、激素組合間均存在顯著差異（表10）。從基因型差異分析，圓果種黃麻愈傷組織的不定根誘導率也明顯優于長果種黃麻，其誘導效果排序為：179＞M4＞YC（圖5）。

表10 黃麻愈傷組織不定根誘導率的方差分析Table 10 Variance analysison jute callus induction rate of adventitious roots

圖5 不同激素組合對黃麻不定根的誘導結果Fig.5 The effect of induction of adventitious roots on different hormone combinations

從激素組合差異分析，黃麻179在13號培養基上的不定根誘導率最高，為50.2%，梅峰4號和尤溪長果在14號培養基中的誘導率達到最大，分別為45.8%和25.4%（圖5）。

對不定根影響因子的分析表明，基因型和激素組合對黃麻不定芽的影響顯著（表10）。試驗中表現為（圖6）：圓果種黃麻的不定根誘導容易，不定根數量多且長勢良好。而尤溪長果的不定根數量少，且多為主根，沒有須根，不定根的長勢較差，幼苗葉片逐漸脫落，死亡。

圖6 黃麻的不定根Fig.6 The adventitious roots of jute

2.6 再生苗的生長情況

選取具有健康不定根和不定芽的愈傷組織，經煉苗處理，轉入外界培養，圓果種黃麻179和梅峰4號黃麻長勢較好（圖7）。而長果種黃麻尤溪長果雖然誘導出不定根，但不定根數量較少，不定芽長勢極差，培養幾天后，不定芽葉片脫落死亡，無法再生植株。

圖7 再生的黃麻幼苗Fig.7 Regeneration seedlings of jute

3 討論與結論

3.1 基本培養基對黃麻種子發芽的影響

基本培養基對植物離體培養植株再生有顯著的影響，大多數文獻報道的愈傷組織的誘導和芽的分化一般都是采用MS培養基[10]。Saha等[8]研究發現，對圓果種黃麻而言，液體培養基更適合于其種子發芽，且黃麻幼苗長勢好、污染率低。本研究選用3種不同的基本培養基，發現圓果種黃麻種子的萌發基本不受培養基差異的影響，但3種培養基對長果種黃麻的發芽率有顯著影響，其中不添加有機物質的MS培養基效果最好。這可能與長果種黃麻種子表面多“褶皺”，可能潛藏有較多的細菌和真菌有關。MS（s-）培養基由于不添加有機元素，不利于菌類的生長，可抑制其生長發育。

3.2 激素對黃麻愈傷組織誘導和再生的影響

黃麻再生體系的研究多集中在外源激素對植株再生過程的調控作用。張高陽[6]研究表明，黃麻愈傷組織誘導需要植物激素TDZ、6-BA和IAA。Bharadwaj等[11]利用黃麻子葉在MS＋0.5 mg／L NAA＋0.5 mg／L BAP＋36 g／L蔗糖上成功誘導出不定芽。T.saha等[12]利用圓果種黃麻的子葉在MS＋2.7 mmol／L NAA＋4.4mmol／L 6-BA上不僅誘導出不定芽，還成功誘導出不定根。本試驗通過均勻設計選用不同的TDZ、6-BA、2，4-D和NAA激素組合，發現不同的激素組合對黃麻愈傷組織的誘導差異顯著。長果種黃麻的不定芽和不定根誘導效率較差，說明植物組織再生的不同階段對外源激素的敏感程度不同。這可能與不同激素的種類和濃度會引起植物細胞在不同發育階段做出不同的反應有關。

3.3 基因型的影響

基因型對作物組培效率的影響已經得到廣泛證明。秦先超等[13]研究表明，福紅992的不定芽誘導率最高，福紅952最差。Saha等[8，12]在研究不同基因型的黃麻組織再生過程中，也發現了基因型差異導致的再生效率不同。苧麻研究中，基因型是苧麻外植體誘導愈傷組織和再生植株的決定因素，相同條件下綠芽誘導率湘苧6號＞湘苧2號＞蘆竹青＞湘苧3號＞C5[14]。相同培養條件下，黃殼早、湘苧2號、巴西麻6號基因型適應性強，華苧1號適應性差[15]。Raoul等[16]對兩種基因型玫瑰茄的愈傷組織誘導試驗表明，兩種基因型的差異明顯。本研究的結果也表明，圓果種黃麻的誘導、分化及植株再生能力均高于長果種黃麻，尤其是在不定芽和不定根的分化及再生植株方面，長果種黃麻的高效再生體系還有待進一步的探索和完善。王曉玲等[15]認為基因型能控制外植體的狀態，決定苧麻是否脫分化和愈傷組織增殖的狀態，而基因型差異造成的黃麻誘導和分化能力差異的原因尚未明確。

3.4 后續研究建議

本研究以4個黃麻品種為研究材料，研究了以黃麻幼莖為外植體構建的組培再生體系。構建的黃麻再生體系為今后的黃麻遺傳轉化研究奠定了基礎。但是，由于研究中的長果種黃麻再生體系還不完善，只選用了尤溪長果和廣巴矮兩個品種，沒有嘗試更多的基因型和激素組合，需在此基礎上做進一步研究。