深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 抑菌活性及對番茄幼苗促生效果研究

梁 松，王建霞，魏甜甜，張靜蕾，胡春艷，姚艷平

（1．山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801；2．山西農業大學 園藝學院，山西 太谷 030801）

化學防治一直在植物病害防治中扮演重要的角 色，但近年來，長期化學防治帶來的問題越來越被人們所重視，例如農藥殘留和生態環境污染等問題。生物防治作為一種安全環保的防治措施，而成為目前防治植物病害研究工作的熱點。木霉菌（spp.）是一種重要的生防真菌，可通過競爭作用、產生抑菌次生代謝產物、重寄生作用、促生作用以及誘導植物抗病性等機理達到防治植物病害的目的，因此木霉菌也被譽為最具開發潛力的生防菌。

木霉菌作為生防真菌已被廣泛報道，自從Oros等于1932 年首次發現木霉對土壤中的幾種真菌具有拮抗作用后，人們開始逐漸認識到木霉菌可以抑制植物病害并且促進植物生長。20 世紀80 年代，研究人員在木霉研究和應用方面就有過諸多報道，20 世紀90 年代至今，木霉菌在植物病害防治和促生方面的研究更加深入。Kottb 等發現，利用棘孢木霉（）的揮發性代謝產物6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6PP）處理擬南芥（），激活了擬南芥的防御反應，減輕了對灰霉菌（）和十字花科鏈格孢病菌（）的侵染。Kishimoto 等發現，經綠色木霉（）的揮發性代謝產物1-辛烯-3-醇處理擬南芥后，通過激活茉莉酸（JA）依賴的防御途徑，增強了擬南芥對病原體的抗性。Malmierca 等發現，經哈茨木霉（）的非揮發性代謝產物Trichodiene 處理番茄后，上調了植物防御相關基因，尤其是水楊酸（SA）相關基因。

番茄（）是我國重要的蔬菜品種之一，其不僅含有多種營養成分而且還具有防癌抗癌的作用，因而成為人們生活中常見的一種蔬菜。在北方，番茄種植主要以保護地栽培為主。由于設施連作次數的增加和不合理的施肥灌溉等農藝措施，引起番茄品質變差、產量下降等問題，成為設施栽培番茄的主要障礙。應用微生物改善植物根際生態環境是目前研究的熱點。目前常見的微生物包括木霉菌（spp.）、芽孢桿菌（spp.）和假單胞菌（spp.）等，這些微生物可以通過抑制病原菌生長、促進植物生長和土壤生物修復等途徑改善土壤微生態環境。

本研究以深綠木霉（）T1和哈茨木霉（）T21 為研究對象，測定其對7 種植物病原真菌的抑菌活性，同時通過灌根法研究其對溫室連作土壤狀態下番茄幼苗的促生效果，為進一步深入研究木霉抑菌和促生機理提供理論基礎和科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試木霉菌株 深綠木霉（）T1、哈茨木霉（）T21，均分離自山西農業大學園藝站溫室土壤。

1.1.2 供試植物病原真菌 尖孢鐮刀菌番茄?；停╢.sp.）、番茄早疫病菌（）、芒果炭疽病菌（）、蘋 果 輪 紋 病 菌（）、禾谷鐮刀菌（）、串珠鐮刀菌（）、玉米鏈格孢葉枯?。ǎ?，均由山西農業大學植物病理實驗室提供。

1.1.3 供試培養基 馬鈴薯葡萄糖固體培養基（PDA）；馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB），以上培養基均經121 ℃高壓滅菌后使用。

1.1.4 供試番茄種子 番茄種子品種：‘東圣一號’。

1.1.5 供試土壤 山西農業大學園藝站常年種植番茄的溫室連作土壤。

1.2 木霉菌對病原真菌的拮抗作用研究

采用平板對峙培養法測定木霉菌對病原菌的拮抗作用，取活化后直徑約為5 mm 的病原菌菌餅，接種于PDA 培養基，在距離病原菌菌餅5 cm 處放置5 mm 木霉菌餅，以不接種木霉菌為對照，每個處理重復3 次。28 ℃恒溫培養7 d，7 d 后計算抑菌率。

抑菌率＝（對照病原菌的直徑－對峙培養病原菌的直徑）/對照病原菌的直徑×100%。

1.3 木霉揮發性代謝產物抑菌效果研究

采用平板對扣法測定木霉揮發性代謝產物的抑菌活性，將5 mm 木霉菌餅接到PDA 培養基中，28 ℃培養3 d 后，在PDA 培養基上接種5 mm 病原菌菌餅，將生長3 d 的木霉皿底與接種病原菌菌餅的皿底對扣，中間間隔一層玻璃紙。放入28 ℃培養箱中培養7 d，以不對扣為對照，計算抑菌率。抑菌率的計算方法參考1.2。

1.4 木霉菌非揮發性代謝產物抑菌效果研究

1.4.1 木霉菌無菌發酵液的制備 將木霉菌株接入PDB 培養基，置于28 ℃，180 r·min的恒溫搖床中培養7 d。培養結束后，先將培養液通過無菌紗布過濾大部分菌絲，再經過12 000 r·min離心10 min，使雜質沉淀，取上清液，過0.22 μm 無菌濾膜，獲得無菌發酵液。將獲得的發酵液保存至4 ℃冰箱。

1.4.2 木霉菌非揮發性代謝產物抑制病原菌菌絲生長試驗 采用固體稀釋法測定，將發酵液與熔融的PDA 培養基（55 ℃）按1∶2 混勻后，均勻倒入平板中，以加入無菌水作為對照，待培養基凝固后，用直徑為5 mm 的打孔器取植物病原真菌菌餅置于培養基中間，放入28 ℃培養箱中培養7 d，每個處理重復3 次，采用十字交叉法計算菌落直徑，并計算抑菌率。抑菌率的計算方法參考1.2。

1.4.3 木霉菌非揮發性代謝產物抑制病原菌孢子萌發試驗 參考凹玻片法并加以改進，制備病原菌孢子懸浮液（1×10個·mL），取無菌1.5 mL 離心管，加入600 μL 病原菌孢子懸浮液和600 μL 木霉菌無菌發酵液，充分混勻，以加無菌水作為對照，取60 μL 混合液置于滅菌凹玻片中，放入鋪有一層濾紙的培養皿中，置于28 ℃培養，分別在8 h 后鏡檢，每個處理重復3 次，觀察孢子萌發情況，以孢子芽管的長度超過孢子直徑的1/2 記作已萌發的孢子。

孢子萌發率＝孢子萌發數/總孢子數×100%

孢子萌發抑制率＝（對照孢子萌發率－處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100%

1.5 木霉菌對番茄幼苗促生效果研究

木霉分生孢子懸浮液的制備：將木霉菌T1、T21 置于PDA 培養基中培養7d，加無菌水制成分生孢子懸浮液，血球計數板計數并調整孢子濃度為1×10個·mL。

先將番茄種子進行育苗，長至四葉一心后進行移栽，將長勢一致的番茄幼苗移栽至帶土盆缽內，盆缽直徑11.7 cm，高9.5 cm，每盆裝土500 g，移植四葉一心的番茄幼苗。放置于光照培養箱中，光周期為14 h 白光（光照強度30 000 lx），10 h 黑夜，白天溫度28 ℃，晚上溫度20 ℃。移栽后3 d，進行木霉孢子懸浮液灌根處理，每2 d 灌根1 次，共灌根3 次，每次每株灌根10 mL 孢子懸浮液，以灌無菌水作為對照，統一定期澆水。各處理15 盆，15 d 后統計相關生長和生理指標。

生長指標測定，株高：子葉節到生長點的長度，單位cm，用游標卡尺測定；莖粗：子葉節的粗度，單位cm，用游標卡尺測定；根長：根基部到最長須根之間的距離，單位cm，用游標卡尺測定；植株鮮質量和干質量：植株用清水反復清洗，再用吸水紙充分吸干水分，測定鮮質量，測定完鮮質量后，將植株放置于105 ℃烘箱中殺青15 min 后，在80 ℃恒溫烘箱下烘至恒重，用千分之一電子天平測定干質量和鮮質量。

生理指標測定，葉綠素含量：利用葉綠素測定儀測定葉片的SPAD 值；根系活力：采用TTC 法測定。

1.6 數據分析

采用Excel 2010 進行數據處理，并采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，應用Duncan 新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 木霉菌與植物病原真菌平板對峙試驗

由表1 和圖1 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對7 種病原菌均具有一定的抑菌效果。其中深綠木霉T1 對玉米葉枯病菌抑菌效果最好，抑菌率為86.16%。哈茨木霉T21 對7 種病原菌的抑菌率均在80%以上，其中對芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率為91.82%。哈茨木霉T21 對7 種病原菌的平板對峙效果均高于深綠木霉T1，說明哈茨木霉T21 在對峙培養中對病原菌的抑制效果強于深綠木霉T1。這可能是因為哈茨木霉T21 在PDA 上生長速度極快，能夠迅速占據空間從而達到抑菌效果。其次哈茨木霉T21 能夠在與病原菌接觸后，產生黃色色素或直接利用病原菌菌絲進行生長，說明哈茨木霉T21 能夠產生抑菌代謝產物并且能夠寄生于病原菌菌絲。

圖1 木霉菌對病原菌的平板對峙結果

表1 木霉菌對病原菌的平板對峙結果

2.2 木霉菌揮發性代謝產物對植物病原菌的抑菌效果

由表2 可知，深綠木霉T1 的揮發性代謝產物對7 種病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深綠木霉T1 對玉米穗腐病菌的抑菌效果最差，抑菌率為39.78%；對芒果炭疽病菌的抑菌效果最好，抑菌率為76.78%。哈茨木霉T21 的揮發性代謝產物對7 種病原菌均沒有抑菌效果，可能是因為哈茨木霉T21 揮發性物質中并沒有對病原菌有抑制作用的物質。

表2 木霉揮發性代謝產物抑菌效果

2.3 木霉菌非揮發性代謝產物對植物病原菌的抑菌效果

2.3.1 木霉非揮發性代謝產物對植物病原菌菌絲生長的影響 由表3 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的非揮發性代謝產物均對7 種病原菌均具有一定的抑菌活性。其中，深綠木霉T1 對番茄早疫病菌的抑制效果最好，抑菌率為75.22%；哈茨木霉T21對番茄枯萎病菌抑菌效果最好，抑菌率為79.21%。

表3 木霉非揮發性代謝產物抑制病原菌菌絲生長效果

2.3.2 木霉非揮發性代謝產物對植物病原菌孢子萌發的影響 由表4 可知，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的非揮發性代謝產物對7 種病原菌均具有一定的抑制效果。其中，深綠木霉T1 對番茄枯萎病菌孢子萌發抑制率最高，可達76.69%，其對番茄早疫病菌和芒果炭疽病菌的孢子萌發抑制率也均達到70%以上；哈茨木霉T21 對番茄枯萎病菌孢子萌發抑制率最高，可達100%，其對玉米穗腐病菌和芒果炭疽病菌也具有較好的孢子抑制萌發率，抑制率可達98.07%，97.41%。

表4 木霉非揮發性代謝產物抑制病原菌孢子萌發效果

2.4 木霉菌對番茄幼苗的促生效果研究

2.4.1 木霉菌對番茄幼苗生長指標的促生效果研究由表5 和圖2 可知，經過深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 灌根后，在株高方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄幼苗株高分別達到13.10，11.80 cm，相較于對照處理分別提高29.19%，16.37%；在根長方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄根長分別達到23.41，22.22 cm，相較于對照處理分別提高42.14%，34.91%；在莖粗方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄莖粗分別達到0.56，0.53 cm，相較于對照處理分別提高14.59%，8.16%；在植株鮮質量方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄植株鮮質量分別達到19.05，16.01 g，相較于對照處理分別提高55.00%，30.27%；在植株干質量方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理后的番茄植株干質量分別達到1.92，1.30 g，相較于對照處理分別提高69.91%，15.04%。

表5 木霉灌根處理下番茄幼苗的生長指標

圖2 木霉菌對番茄幼苗的促生效果研究

2.4.2 木霉菌對番茄幼苗生理指標的促生效果研究由表6 可知，在根系活力方面，經哈茨木霉T21 處理的番茄幼苗根系活力達到2.26 mg·g·h，顯著高于深綠木霉T1 處理和對照處理，相較于對照處理提高69.92%，深綠木霉T1 處理和對照處理之間在番茄幼苗根系活力方面無顯著性差異；在SPAD 方面，經哈茨木霉T21 和深綠木霉T1 處理的番茄幼苗葉片SPAD 值均顯著高于對照處理，相較對照處理分別提高20.97%，20.75%。

表6 木霉灌根處理下番茄幼苗的生理指標

3 結論與討論

本文研究了深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對7種病原菌的抑菌活性以及對番茄幼苗生長的影響。研究發現，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 在平板對峙試驗中，均能夠占據營養空間從而達到抑菌目的，其中哈茨木霉T21 對7 種病原菌的抑菌活性均高于深綠木霉T1，說明哈茨木霉T21 在平板對峙試驗中的抑菌效果優于深綠木霉T1。在揮發性代謝產物抑菌試驗中，深綠木霉T1 對7 種病原菌均表現出一定的抑菌活性，而哈茨木霉T21 的揮發性代謝產物并沒有抑菌活性，說明深綠木霉T1 在揮發性物質上的抑菌能力高于哈茨木霉T21。在非揮發性代謝產物試驗中，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對7種病原菌均表現出一定的抑菌活性，說明2 株木霉的非揮發性代謝產物中均存在抑制病原菌菌絲生長和病原菌孢子萌發的物質。在對番茄幼苗的促生試驗中，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 對番茄幼苗的相關生長指標和生理指標均有促進作用，說明在溫室連作土壤狀態下，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21均對番茄具有促生效果。

木霉菌具有多種生防機理，且多種生防機理相互配合。劉佳等利用平板對峙和木霉代謝產物的活性測定長枝木霉T6 對黃瓜枯萎病的抑菌效果，并經過室內防效測定其生防效果，結果發現,長枝木霉T6 對黃瓜枯萎病的室內盆栽防效為69.06%，具有較好的生防效果。王子晴等通過測定木霉對菌核病菌的MDA 含量、CAT 活性、SOD 活性和POD活性，結果發現,經過木霉處理后，菌核病菌的MDA含量顯著增加、CAT、SOD 和POD 活性均有所下降，表明木霉處理能夠使病原菌氧自由基增加，抗氧化系統破壞，最終導致病原菌死亡。陳迪等通過測定木霉幾丁質酶的活性來分析生防木霉菌株的抑菌活性。由于幾丁質是病原菌細胞壁的主要成分，生防木霉菌可以通過分泌幾丁質酶來裂解病原菌細胞壁從而使其死亡。據相關文獻顯示，木霉能夠產生70 種以上次級代謝產物，包括烴類、醇類、內酯、呋喃烷、酮類、醛類、酯類、芳香族化合物、雜環化合物和各種萜類化合物以及木霉素、抗菌肽和膠霉素等抗生素。這些次級代謝產物在木霉生物防治過程中發揮了重要的作用。本研究發現，深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的平板對峙及代謝產物對7 種病原菌均具有較好的效果，可能是因為深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 可以通過空間營養競爭以及產生次級代謝產物等生防機理協同拮抗病原菌。但本研究未能分析具體是哪一種次級代謝產物發揮了抑菌作用，也未能測定深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 的室外生防潛力，只測定出深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 具有較好的離體抑菌效果。這些都是今后要深入研究的方向。

促生作用也是木霉菌生防機理的一個重要方面，因為木霉菌本身就是一種重要的植物根際共生微生物，所以木霉對很多植物都具有促生效果。許多木霉可以產生植物激素（生長素、赤霉素），以及產生1-氨基環丙烷-1 羧酸脫氨酶（ACC）調節植物體內乙烯水平。另外，木霉菌可以產生次級代謝產物來刺激植物生長發育。Vinale 等發現，經哈茨木霉（） 的非揮發性代謝產物harzianum acid 處理番茄后，顯著促進了番茄幼苗的生長，提高種子發芽率。Ruocco 等發現，經長枝木霉（）的非揮發性代謝產物Hydrophobin 處理煙草和番茄后，誘導并激活了煙草和番茄體內防御相關反應，包括產生活性氧（ROS）和其他化合物，并刺激植物根的形成和生長。本研究采用的土壤為溫室番茄連作土壤，結果發現，經過深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 處理后，番茄相關生長和生理指標均高于對照處理，說明深綠木霉T1 和哈茨木霉T21 具有較好的促生效果，但未能研究2 株木霉對番茄幼苗的促生機理，這也是今后要深入研究的方向。