鏈霉菌沉默基因簇激活在天然產物生物合成中的研究進展

馬 正,施 越,章金垚,俞曉平

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室,浙江 杭州 31008)

鏈霉菌(Streptromyces)是在土壤中發現的絲狀革蘭氏陽性細菌[1],是放線菌中最大的一個種屬,可產生多種抗病毒、抗真菌[2-4]等具有生物活性的次級代謝產物。自20世紀40年代首次報道鏈霉菌能產生抗生素以來,已從鏈霉菌中發現了大量的新型抗生素[5]。然而,經過幾十年傳統生化篩選分離,化合物發現的重復率不斷提高。同時,眾多廣譜抗生素耐藥性病原微生物不斷涌現,因此,新型天然化合物的挖掘和創制顯得尤為重要。

隨著基因組測序方法、生物信息學技術的發展[6-8],目前包括antiSMASH[9]和PRISM[10]等在內的諸多分析工具已用于預測天然產物生物合成基因簇及其編碼產物的化學結構[11]。大量鏈霉菌基因組測序分析表明:多數鏈霉菌基因組中8%～10%基因序列與次級代謝相關,一般都蘊含著幾十個次級代謝產物生物合成基因簇,其數目遠遠超過目前從鏈霉菌中分離得到的化合物種類[12-13]。由此表明,鏈霉菌具有合成新天然化合物的巨大潛力[14]。然而,在常規實驗室條件下,大多數天然產物(natural products,NP)的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster,BGC)不表達或低表達,這些處于“沉默”狀態的生物合成基因簇,被稱為沉默基因簇(silent biosynthetic gene cluster)或隱性基因簇(cryptic biosynthetic gene clusters,CBGCs)。目前,如何激活鏈霉菌中“沉默”基因簇的表達,已成為開發新天然化合物方面的研究熱點。

本文將從調控基因的過表達/敲除、基因簇重構/異源表達、共培養、核糖體工程技術、基于報告基因的定向激活、clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9(CRISPR/Cas9)編輯技術等方面綜述一些激活鏈霉菌沉默生物合成基因簇的研究進展。

1 利用調控基因激活沉默基因簇

鏈霉菌細胞內存在復雜且龐大的調控系統,鏈霉菌次級代謝產物的生物合成受到包括途徑特異性、多效性以及全局性調控基因在內的多層級嚴格調控[15]。因此,無論是通過正向調控基因的過表達還是負向調控基因的敲除,都是激活沉默基因簇表達最直觀的方法之一。

1.1 過表達正調控基因

SARP(Streptomycesantibiotic regulatory proteins)普遍存在于鏈霉菌中并參與調控次級代謝產物的生物合成基因簇,該類調控基因的表達可激活沉默生物合成基因簇。Wu等人利用組成型啟動子ermE*將12個SARP類調控基因在Streptomycestsukubaensis L20中過表達,發現tsuR1基因的過表達會產生新型蒽環類藥物tsukubarubicin[16],它對枯草芽孢桿菌具有拮抗活性。

Krause等在變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)中過表達始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)的SARP類調控基因papR2,導致S.lividans十一烷基靈菌紅素(undecylprodigiosin,Red)的基因簇被激活。主要機理是由于過表達的papR2彌補了S.lividansRed的生物合成基因簇中SARP調節因子(RedD)的調節功能[17],從而實現Red的生成。除了SARP類調控基因外,LuxR家族調控基因也是常見的調控因子[18]。例如在鏈霉菌SN-593中過表達LuxR家族調控基因RevQ和RevU可成功激活苯甲醌類抗生素reveromycin A的合成[19]。

1.2 敲除負調控基因

有些調控因子發揮正向調控作用,但有些調控因子的表達反而導致基因簇的沉默,不利于次級代謝產物的生物合成。Li等人在S.coelicolorA3(2)發現一個I型PKS的基因簇(cpk),通過敲除途徑特異性負調控基因scbR2(γ-丁內酯蛋白),使菌株喪失放線紫紅素(Act)、Red、鈣依賴性抗生素(CDA)生產的同時,成功激活出一種黃色色素coelimycin P1[20]。

AdpA(A因子依賴蛋白A)是一種多效性調節因子,通常能參與調節細胞周期分化和抗生素的合成[21]。Becerril等構建粘土鏈霉菌Streptomycesargillaceus的AdpA缺失突變株(Streptomycesargillaceu-ΔadpAa),分析發現該突變株發酵主產物米曲霉素(mithramycin)的產量明顯下降的同時有兩個新物質germicidin B/C被激活產生[22],這兩個化合物已證實對孢子萌發具有協調作用[23]。同樣,Xu等人報道圈卷產色鏈霉菌Streptomycesansochromogenes中oviedomycin的生物合成基因簇由于adpA基因的缺失而被激活[24]。

1.3 轉錄因子誘餌

轉錄因子誘餌(transcription factor decoy,TFD)是模擬阻遏蛋白可能與目標基因簇特異性結合一段DNA片段,通過構建質粒導入宿主增加TFD的拷貝數,“吸引”阻遏蛋白與之結合,從而“解鎖”阻遏蛋白對基因簇的負向調控,實現目標基因簇的激活[25](圖1)。TFD策略已廣泛應用于哺乳動物細胞和臨床研究[26-27],Wang等人首次嘗試在鏈霉菌中采用TFD策略激活沉默基因簇[28],在S.lividans66中激活了放線菌素和十一烷基靈芝菌紅素生物合成基因簇的表達。該策略也成功激活了Streptomycessp. F-5635中8個沉默基因簇中的3個沉默基因簇(編碼butyrolactol A、oxazolepoxidomycin A)的表達(成功率為37.5%)[28]。

圖1 轉錄因子誘導示意圖[28]

2 基因簇重構與異源表達

基因簇處于“沉默”狀態的原因是復雜和多方面的,往往是由于受到直接或間接性阻遏造成的,因此,去除或“繞過”阻遏因素是激活沉默基因簇的關鍵。異源表達作為一種將天然產物化學類型與其基因型聯系起來的遺傳操作工具,即將沉默基因簇在遺傳代謝背景清楚的模式菌株中表達,可有效解除天然菌株中復雜調控網絡的影響,從而激活沉默基因簇的表達[29]。選擇合適的宿主是沉默基因簇異源表達成敗的關鍵。選取宿主一般有一下三點原則:①宿主遺傳背景清楚,易培養,生長周期短;②易于轉化和遺傳改造,有利于異源沉默基因簇的高效表達;③宿主能供給異源沉默基因簇編碼次級代謝物合成所需的前體物質,盡可能少有競爭途徑。

2.1 沉默基因簇異源表達及其宿主選擇

目前,多個鏈霉菌已被開發成為異源基因簇表達的良好宿主,如S.coelicolor、S.lividans、S.albus等。比如,S.lividans的Act、Red和CDA基因簇在轉錄水平上基本處于“沉默”狀態,且菌株遺傳背景清楚,合成副產物少,因此,S.lividans可作為沉默基因簇異源表達的理想宿主[30]。例如,工程菌株S.lividansΔDYA11是通過刪除其11個內源性生物合成基因簇(大小為228.5 kb)并插入另外兩個噬菌體ΦC31attB整合位點構建而成[31]。將核苷類抗生素tunicamycin、蘭硫肽deoxycinnamycin的生物合成基因簇在該菌株中進行了表達,結果發現S.lividansΔDYA11合成deoxycinnamycin和tunicamycin的產量是在未改造菌株S.lividnasTK24中表達后產量的4倍。

StreptomyccesalbusJ1074是SalI限制修飾系統存在缺陷的S.albusG衍生株,其存在7個rRNA操縱子且具有較小的基因組(6.8 Mbp),因此,S.albusJ1074在大多數沉默基因簇異源表達方面具有代謝背景相對“簡潔”、生長速率快等優勢[32],已被廣泛用作已知基因簇或沉默基因簇異源表達的理想宿主[33-34]。最近Myronovskyi等人報道了對底盤菌株S.albusJ1074的改造,通過對15個內源基因簇(大小500 kb)的缺失和ΦC31attB整合位點的增加,獲得衍生株S.albusDel14[35],并成功實現了來源Frankiaspp.沉默基因簇的異源表達,產生了新型化合物fralnimycin[36]。

2.2 基因簇重構和修飾

異源表達能“繞過”原宿主的調控網絡來激活沉默基因簇,但通常表達產物的產量較低,分離提取困難。因此,需要提高異源沉默基因簇的轉錄強度而提升次級代謝產物產量。目前,通過生物合成基因簇的重構和修飾(包括DNA組裝和啟動子工程[37]),即利用組成型啟動子或誘導型啟動子替換原啟動子(native promoter),增強基因轉錄水平,從而更有效的激活沉默基因簇在宿主中的異源表達[38-40](圖2)。

圖2 利用啟動子替換激活沉默基因簇示意圖[40]

在宿主S.coelicolorM145中,Du等以neo(卡那霉素抗性基因)為報告基因,比較了3個組成型啟動子ermEp*、SF14p、hrdBp和一個誘導型啟動子tcp830p的轉錄活性,表明hrdBp表達活性最好。谷氏菌素(gougerotin)生物合成基因簇中GouA、GouM-B(一種多順反子轉錄單位)和GouN的自身啟動子被hrdBp取代,將重構的基因簇在S.coelicolorM146中進行異源表達后,谷氏菌素的產量較未修飾表達的產量增加了10倍以上[41]。

為實現Streptomycesorinoci壯觀霉素生物合成基因簇在S.lividans中的表達,Shao等人對其基因簇進行重構[42],利用7種不同的強啟動子和1種誘導型鏈霉菌啟動子分別啟動基因簇中8個基因的表達,借助TAR克隆技術(transformation-associated recombination,TAR)將重構的基因簇整合到S.lividans基因組上進行異源表達,最終壯觀霉素的產量達100 g/L。

3 共培養

自然環境下,鏈霉菌與許多細菌長期共存且彼此相互作用[43]。因此,在這些細菌和鏈霉菌共培養(模擬鏈霉菌與其他菌株持續相互作用的環境)的過程中,會產生多種“誘導子”,從而極大地影響鏈霉菌的次級代謝,刺激產生新的次級代謝物。目前共培養激活沉默基因簇的機制主要可以分為四種情況:①空間和營養的競爭從而產生“抵制”;②菌株之間的物理接觸;③菌株之間化學信號傳遞(如信號分子);④菌株間遺傳信息的“水平轉移”。

3.1 鏈霉菌和非鏈霉菌細菌共培養

鏈霉菌和非鏈霉菌的細菌共培養時,鏈霉菌會識別細菌表面包括受體蛋白在內的一些蛋白,并產生應答,從而激活新的代謝物來防御“入侵”?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis)和大腸桿菌(Escherichiacoli)等模式菌株均可被用作鏈霉菌的共培養菌株。例如當StreptomycesMg1與B.subtilis3610共培養時,StreptomycesMg1會產生抑制甚至裂解B.subtilis3610的查爾霉素A(Chalcomycin A)[44]?；罹w或熱滅活的枯草芽孢桿菌均能激活S.coelicolor和S.lividans中Red的產生[45-46]。細菌代謝產生的小分子物質也可作為信號分子激活鏈霉菌產生新的天然產物。例如,Perez等發現黃色粘球菌(Myxococcusxanthus)與S.coelicolor共培養時,黃色粘球菌會分泌裂解酶,從而激發S.coelicolor形成異常菌絲和產生Act以阻止黃色粘球菌的“破壞”[47]。

除上述提及的枯草芽孢桿菌,黃色粘球菌之外,另外一些病原菌、致病菌(例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa)和鏈霉菌共培養時,也能激活鏈霉菌合成granatomycin D、dihydrogranaticin B等物質[48]。

3.2 不同鏈霉菌共培養

在鏈霉菌-鏈霉菌共培養過程中,由可擴散底物如γ-丁內酯(γ-butyrolactone)和次級代謝物本身介導的種間相互作用被認為是激發次生代謝的主要因素[48]。特別是,GBL(如A因子、virginiae butanolides和IM-2)是廣泛分布的信號分子,參與鏈霉菌間的信號傳遞[50]。由Streptomyces153產生的聚醚抗生素普羅莫霉素(promomycin),可作為離子載體,通過形成孔道增加K+離子通過細胞膜的外流,抑制細菌生長,而外流的K+離子同時也作為鏈霉菌種間通訊的信號分子,誘導共培養的Streptomyces574產生抗生素。此外包括鹽霉素、莫能菌素和黑霉素在內的其它聚醚抗生素也可激活Streptomyces574抗生素的產生[51]。

除信號分子外,一種鏈霉菌的次級代謝物本身也可刺激另一種與之共培養的鏈霉菌次級代謝產物的合成[52]。Streptomycessp. SPB74、S.albusJ1074、S.viridochromogenesDSM40736和Streptomycessp.E14在內的4種鏈霉菌均可產生鐵載體siderophores,在與S.coelicolorM145共培養時,可作為“誘導子”激活S.coelicolorM145產生出γ-actinorhodin、pridiginine(可作為免疫抑制劑抗癌藥物)、celichelin、desferrioxamine B(可用于治療鐵中毒)等[53]。

4 核糖體工程

核糖體工程是一種旨在通過調節核糖體相關元件(核糖體蛋白/rRNA)來激活沉默基因并增加抗生素產量的方法,這種方法主要基于引入對攻擊核糖體藥物的抗性突變,如rpoB(編碼ribonucleic acid polymerase,RNAP的β亞基)和rpsL(編碼核糖體蛋白S12)基因的突變分別對利福平和鏈霉素產生抗性,影響菌株的轉錄和翻譯水平,從而改變其代謝產物的合成能力(圖3)。目前此方法已在菌株改良和新型抗生素發現等方面得到了較好的應用[54-56]。Shentu等分別利用利福平(Rifampicin,Rif)、鏈霉素(Streptomycin,Str)、慶大霉素(Gentamicin,Gen)、巴龍霉素(Paromomycin,Par)和紅霉素(Erythromycin,Ery)等篩選獲得淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628的自發單一抗性突變株[57],其中的Str低耐受突變株SD143發生缺失突變,激活S.diastatochromogenes1628產生了多種次級代謝產物。

圖3 核糖體工程原理示意圖[59]

目前關于核糖體工程技術的機制研究較為深入,對于Rif抗性突變株,rpoB基因發生H437D或H437L有益突變有助于次級代謝產物的大幅提升甚至激活沉默基因簇;對于Str抗性突變株產生了正向效果,往往是rpsL基因發生K88E的有益突變,影響核糖體循環因子frr的表達水平從而提高翻譯效率[58-59]。Zhang等人[60]利用一種即插即用(plug-and-play)質粒系統直接過表達含上述有益突變的外源rpsL和rpoB基因,并分別在鏈霉菌S.lividans、S.coelicolorA3(2)、Streptomycessp. FXJ6.204和Streptomycessp. FXJ8.102中進行表達,成功激活了多個沉默基因簇,其中Streptomycessp. FXJ8.102產生了兩種新型芳香族聚酮類抗生素piloquinone和homopiloquinone。

5 依賴報告基因的沉默基因簇定向激活

上述利用共培養、核糖體工程技術等策略雖已成功應用于沉默基因簇的激活,但結果具有較高的隨機性,通過不可預知的阻遏因素的解除,實現沉默基因簇的激活,但事先無法預判,無法精準實現目標沉默基因簇的激活。目前已有不少報道,以報告基因為指示(reporter gene-guided),結合隨機突變篩選等手段,可實現目標沉默基因簇的定向激活[61-62]。

Guo等建立了一種高效的基于報告基因(neo)的核糖體工程突變株篩選策略(reporter-guided mutant selection,RGMS),成功激活了StreptomycesvenezuelaeISP5230中杰多霉素(jadomycin)基因簇的表達和Streptomycessp. PGA64中沉默基因簇pga的表達,分離得到了2個新的蒽醌類化合物gaudimycins D/E[63]。

Li等人在RGMS基礎上,用鄰苯二酚雙加氧酶-卡那霉素抗性基因(XylE-neo)雙報告基因體系取代了單報告基因neo[64]。通過表型(菌落顏色變黃)和卡那霉素抗性進行兩輪篩選鑒定,成功實現Streptomyceslavendulae中鏈霉素F(streptothricin F)合成基因簇的激活。

6 激活策略的新工具:CRISPR/Cas9系統

鏈霉菌遺傳操作涉及的基因/基因簇敲除,基因簇重構,啟動子替換等在鏈霉菌遺傳改造等方面已有許多成功的案例,但傳統的遺傳操作周期長,且較為繁瑣[65]。近期,隨著CRISPR/Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技術的應運而生,為鏈霉菌遺傳操作的簡潔化和高效化提供了契機[66-69]。CRISPR/Cas9生物學的基本信息及其作用機制方面已有較為詳細的研究,其作用原理是利用Cas9內切酶與引導RNA(gRNA)形成復合物,并被引導到與gRNA間隔區序列互補的Protspacer序列,特異性剪切雙鏈斷裂,然后再通過天然的非同源末端連接修復(NHEJ)或同源定向修復(HDR)機制修復雙鏈,從而完成基因敲除等操作[70-71]。Pristinamycin I(PI)和Pristinamycin II是由Streptomycespristinaespiralis產生的兩種組分,Meng等人[72]利用CRISPR/Cas9技術敲除Pristinamycin II生物合成基因簇和缺失阻遏調控基因papR3,構建了一株PI單組分產生菌,大幅增加PI生物效價。

與此同時,CRISPR/Cas9技術在激活鏈霉菌沉默基因簇方面也得到了較好地應用。利用CRISPR/Cas9技術在S.albusJ1074的NRPS基因簇和PKS-NRPS基因簇的核心基因上游區域插入組成型啟動子permE*,從而激活6-epi-alteramides A/B的產生[73]。同樣,基于CRISPR/Cas9技術用kasOp*啟動子代替沉默基因簇核心基因的天然啟動子,成功激活了S.albus、S.lividans、玫瑰孢鏈霉菌StreptomycesroseosporusNRRL15998等5株鏈霉菌中10個沉默基因簇的表達[74-75]。這些沉默基因簇涉及I、II和III型PKS、非核糖體多肽合成酶(NRPS)、PKS-NRPS雜合基因簇等。同時,CRISPR/Cas9技術在編輯基因組、優化底盤細胞性能、基因定點突變等方面也得到了廣泛應用,顯示出作為分子生物學工具的巨大潛力[76-79]。

7 結論與展望未來

從微生物次級代謝產物中分離天然活性化合物是開發新型藥物的主要途徑之一,但傳統的篩選方法面臨較大的瓶頸,如:分離純化前無法預知活性物質結構是否具有新穎性,利用活性追蹤分離得到的往往是已報道的物質[80],且耗時長。近年來,隨著基因組測序技術和生物信息學的不斷發展,激活沉默基因簇已成為新型藥物創制的重要研究策略之一[81]。

在這篇綜述中,我們總結了目前激活沉默基因簇的一些常用的方法。如過表達正調控基因、敲除負調控基因對調控網絡進行修飾,或繞過原宿主的調控進行異源表達,以激活沉默基因簇的表達。隨機誘變和核糖體工程技術等雖展現出一定的優勢,但篩選過程工作量大、周期長,同時對沉默基因簇的激活具有一定的盲目性。為克服隨機篩選的盲目性和繁瑣性,以報告基因為導向,結合高通量篩選定向激活沉默基因簇也在逐漸被越來越多的學者采用。隨著CRISPR/Cas9技術的出現和發展,在遺傳改造鏈霉菌以及激活沉默基因簇研究方面逐漸體現出了優越性。相信隨著生物信息學的發展、組學的深入研究,以及鏈霉菌遺傳改造技術的進步,將會有更多的鏈霉菌沉默基因簇被挖掘和激活,創制更多的新天然化合物。