長鏈非編碼RNA ENST00000415964調控miR-214/DKK3對急性白血病細胞增殖、凋亡的影響

周立濤 陶善東 史文婷 鄧媛 朱家斌

(南京醫科大學附屬淮安第一醫院血液科，江蘇 淮安 223300)

白血病是一種侵襲性血液惡性腫瘤，其特征是未成熟髓樣細胞的異常增殖和分化〔1〕。盡管治療方法不斷增加，但大多數患者仍會復發并在緩解后死亡，預后仍然不理想〔2〕。探索新的生物標志物用于白血病的診斷、預后和治療靶標十分必要，以便制定更有效的監測和治療方案。近年來，非編碼(nc)RNA，包括長鏈(l)ncRNA和微小RNA(miR)，因其在白血病發病機制中的關鍵作用而受到越來越多的關注〔3〕。lncRNA是一組進化保守的ncRNA，長于200個核苷酸，可在表觀遺傳、轉錄和轉錄后水平上調節基因表達〔4〕。lncRNA常在人類惡性腫瘤中異常表達，并參與廣泛的生物學過程，包括細胞增殖、凋亡、轉移和癌變〔5〕。既往研究表明，lncRNA ENST00000415964在急性髓細胞性白血病患者中表達下調〔6〕，但其在白血病中的生物學功能與機制尚不清楚。miR是另一類短的單鏈ncRNA，長度約為20個核苷酸，miR通過與靶mRNA的3′非編碼區(UTR)結合，導致mRNA的降解或翻譯抑制，在基因表達的調控中起著至關重要的作用〔7〕。在這些miR中，miR-214已被證明在白血病患者中表達上調，抑制其表達有助于增強耐藥的慢性淋巴細胞白血病細胞對氟達拉濱的敏感性〔8〕，表明miR-214可能成為白血病潛在的預后生物標志物。資料顯示，lncRNA可充當競爭性內源(ce)RNA調控miR的表達，隨后在轉錄后水平上調控miR靶基因的表達，從而影響癌癥進展〔9〕。但ENST00000415964是否可作為miR-214海綿調節白血病的發生發展過程仍然未知。DKK3是一種抑癌基因，DKK3基因mRNA的相對表達在急性髓性白血病患者中顯著下調，其甲基化水平是患者預后的重要影響因素〔10〕。本研究探討ENST00000415964調控在miR-214/DKK3對急性白血病細胞增殖、周期和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1臨床標本 在2015～2018年南京醫科大學附屬淮安第一醫院血液科的32例急性白血病患者和17例健康者(對照組)中獲取臨床標本。本研究獲得患者及其家屬知情同意，并通過醫院倫理委員會批準。急性白血病患者是根據世界衛生組織(WHO)的造血和淋巴組織腫瘤分類(2016年)〔11〕進行初步診斷。使用Ficoll溶液進行單核細胞的分離，用于實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測。

1.2細胞與主要試劑 白血病細胞K562購自美國典型培養物保藏中心，RPMI1640培養基購自美國Gibco，Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen，PrimeScriptTMRT試劑盒、Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa，細胞計數試劑盒(CCK)-8購自日本Dojindo，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、P21、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、DKK3抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自英國Abcam，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore，碘化丙啶(PI)細胞周期分析試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自上海Beyotime。

1.3細胞培養、轉染與分組 細胞K562在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，在37℃、5% CO2、飽和濕潤條件下孵育。pcDNA3.1-ENST00000415964及其陰性對照pcDNA3.1、miR-214及其陰性對照miR-NC、anti-miR-214及其陰性對照anti-miR-NC、si-DKK3及其陰性對照si-NC均獲自上海GenePharma。將對數生長期的細胞K562分為pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)，pcDNA3.1-ENST00000415964組(轉染pcDNA3.1-ENST00000415964)，pcDNA3.1-ENST0-0000415964+miR-NC組(共轉染pcDNA3.1-ENST-00000415964和miR-NC)，pcDNA3.1-ENST00000-415964+miR-214組(共轉染pcDNA3.1-ENST00-000415964和miR-214)，pcDNA3.1-ENST00000415-964+si-NC組(共轉染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-NC)，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組(共轉染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-DKK3)，miR-NC組(轉染miR-NC)，miR-214組(轉染miR-214)，anti-miR-NC組(轉染anti-miR-NC)，anti-miR-214組(轉染anti-miR-214)。細胞轉染時，將細胞K562接種于6孔板，每孔1×105個細胞，細胞匯合至70%密度時，嚴格按照Lipofectamine2000試劑說明書指示，按照上述分組進行轉染，收集轉染48 h后的細胞進行后續實驗。

1.4qRT-PCR檢測ENST00000415964、miR-214表達 使用TRIZOL試劑提取急性白血病患者樣品和轉染后細胞K562的總RNA，采用PrimeScriptTMRT試劑盒進行逆轉錄，以得到的cDNA為模板，利用Premix Ex Taq試劑盒于ABI 7500系統中進行qRT-PCR。引物序列如下：ENST00000415964正向5′-CTCCAAGCATGACACAGACA-3′，反向5′-CCTTTAAGTCCCCAATTCCA-3′；GAPDH正向5′-CGCTCTC-TGCTCCTCCTGTTC-3′，反向5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′；miR-214正向5′-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3′，反向5′-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC-3′；U6正向5′-ATTGGAACG ATACAGAGAAGATT-3′，反向5′-GGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。ENST00000415964的表達標準化為GAPDH，miR-214的表達標準化為U6，并通過2-△△Ct法進行計算。

1.5CCK-8法分析細胞增殖 將轉染后的細胞K562以5×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，48 h加入10 μl CCK-8試劑，繼續孵育，2 h后于酶標儀測定450 nm處的細胞吸光度，計算細胞存活率(%)。

1.6流式細胞術評估細胞周期和凋亡 PI細胞周期分析試劑盒用于評估K562細胞的周期。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒用于檢測K562細胞的凋亡。將轉染后的細胞K562以1×105個細胞/孔的密度接種于24孔板，培養48 h后，用冰冷的磷酸鹽緩沖液沖洗并離心以除去上清液。根據試劑盒說明書的步驟，通過FACScan流式細胞儀確定細胞的周期和凋亡。

1.7Western印跡測定P21、Caspase-3、DKK3蛋白表達 向細胞K562中加入RIPA裂解液以提取蛋白，按照二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒的步驟估算蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，并轉移至PVDF膜。PVDF膜經5%脫脂牛奶封閉2 h，與稀釋度為1∶1 000的P21、Caspase-3、DKK3一抗孵育過夜，與HRP標記的二抗孵育2 h，然后使用增強的化學液顯影曝光。GAPDH被用作對照，以分析P21、Caspase-3、DKK3蛋白表達。

1.8生物信息學預測和雙熒光素酶實驗驗證ENST00000415964對miR-214、miR-214對DKK3的靶向調控 在線預測工具Starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測發現，ENST00000415964的3′UTR含有miR-214的互補序列，DKK3的3′UTR含有miR-214的互補序列。分別合成包含miR-214互補位點的ENST00000415964或DKK3的3′UTR野生型(WT)結合序列，并將其克隆到pmirGLO熒光素酶載體，以生成WT-ENST00000415964或WT-DKK3。構建相應的突變型(MUT)序列，并將其克隆到相同的載體中，即MUT-ENST00000-415964或MUT-DKK3。轉染前，將細胞K562接種于24孔板，使用Lipofectamine 2000試劑分別將WT-ENST00000415964或MUT-ENST00000415964與miR-NC或miR-214共轉染，WT-DKK3或MUT-DKK3與miR-NC或miR-214共轉染。轉染后48 h收集細胞，并使用雙熒光素酶報告基因測定系統測定熒光素酶活性。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、組間多重比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1ENST00000415964在急性白血病患者和對照組骨髓細胞中的表達 急性白血病患者ENST00000415964表達量(0.29±0.03)明顯少于對照組(1.00±0.05；t=62.241，P=0.000)。

2.2過表達ENST00000415964對細胞K562增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964組細胞K562的G0期細胞百分比顯著增加，S期顯著減少，細胞存活率顯著降低，P21蛋白表達量顯著提高(P<0.001)，而G1期細胞百分比無顯著變化(P>0.05)。見表1，圖1。

表1 過表達ENST00000415964對細胞K562增殖的影響

圖1 P21蛋白表達

2.3過表達ENST00000415964對細胞K562凋亡的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1ENST-00000415964組細胞K562中ENST0-0000415964表達量、細胞的凋亡率及Caspase-3蛋白水平顯著提高(P<0.001)。見表2、圖2。

表2 過表達ENST00000415964對細胞K562凋亡的影響

1，2：pcDNA3.1組，pcDNA3.1-ENST00000415964組

2.4ENST00000415964靶向調控miR-214 生物信息學預測結果顯示，miR-214是ENST000-00415964的候選靶基因。見圖3。與miR-NC和WT-ENST00000415964共轉染(1.00±0.05)相比，miR-214和WT-ENST00000415964共轉染明顯降低細胞K562的熒光素酶相對活性(0.36±0.03；t=32.928，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-ENST00000415964共轉染后，細胞K562的熒光素酶相對活性無顯著變化〔(0.99±0.06)vs(0.97±0.05)；t=0.768，P=0.454〕。與pcDNA3.1組(1.01±0.05)相比，pcDNA3.1-ENST00000415964組明顯減少細胞K562內miR-214表達量(0.23±0.03；t=40.131,P=0.000)。

2.5過表達miR-214能減輕ENST00000415964對細胞K562增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214組細胞K562的G0期細胞百分比明顯減少，S期明顯增加(P<0.001)，而G1期細胞百分比無明顯變化(P>0.05)，細胞存活率明顯提高，凋亡率明顯降低(P<0.001)，miR-214表達量明顯增加，P21和Caspase-3蛋白表達量明顯減少(P<0.001)。見表3、圖4。

圖3 ENST00000415964靶向miR-214

表3 過表達miR-214能減輕ENST00000415964對細胞K562增殖、凋亡及相關蛋白的影響

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-NC組，pcDNA3.1-ENST00000415964+miR-214組

2.6抑制DKK3能減輕ENST00000415964對細胞K562增殖、凋亡的影響 與pcDNA3.1-ENST00000-415964+si-NC組相比，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組細胞K562的G0期細胞百分比明顯減少，S期明顯增加(P<0.001)，而G1期無明顯變化(P>0.05)，細胞存活率明顯提高，凋亡率明顯降低(P<0.001)，DKK3、P21和Caspase-3蛋白表達量明顯減少(P<0.001)。見圖5、表4、表5。

1，2：pcDNA3.1-ENST00000415964+si-NC組，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組

表4 抑制DKK3能減輕ENST00000415964對細胞K562增殖、凋亡的影響

表5 P21、Caspase-3、DKK3蛋白的表達

2.7miR-214靶向調控DKK3 生物信息學預測結果顯示，DKK3的3′UTR含有miR-214的互補序列。見圖6。與miR-NC和WT-DKK3共轉染(0.96±0.06)相比，miR-214和WT-DKK3共轉染明顯減少細胞K562的熒光素酶活性(0.20±0.03；t=33.988，P=0.000)；miR-NC或miR-214和MUT-DKK3共轉染細胞K562的熒光素酶活性無顯著變化〔(0.97±0.06)vs(0.98±0.06)；t=0.354，P=0.728〕。與miR-NC組(0.28±0.03)相比，miR-214組明顯減少細胞K562的DKK3蛋白表達量(0.09±0.01；P<0.05)，與anti-miR-NC組(0.30±0.03)相比，anti-miR-214組顯著提高DKK3蛋白水平(0.63±0.04；P<0.05)。見圖7。

圖6 DKK3的3′UTR含有miR-214的互補序列

1～4:miR-NC組,miR-214組，anti-miR-NC組，anti-miR-214組圖7 DKK3蛋白的表達

3 討 論

隨著高通量分析的發展，已經鑒定出越來越多與腫瘤相關的ncRNA，特別是lncRNA、miR和mRNA已被證明通過各種生物學過程發揮著多種功能，它們的失調可能觸發和(或)促進病理改變〔12〕。本研究證明了lncRNA ENST00000415964在白血病患者中的表達顯著下調，而ENST00000415964的過表達可抑制白血病細胞增殖，阻滯細胞周期，同時誘導其凋亡。ENST00000415964充當ceRNA，通過競爭性的結合miR-214來調控DKK3的表達，影響白血病細胞的增殖、周期和凋亡過程。

據報道，lncRNA在癌細胞的惡性表型中起重要作用，lncRNA在腫瘤細胞中異常表達，其失調會產生致癌或腫瘤抑制功能，與包括白血病在內的疾病密切相關〔13，14〕。如lncRNA HAND2-AS1在慢性粒細胞白血病中被下調，通過上調miR-1275表達，抑制白血病細胞的增殖并促進其凋亡〔15〕。SNHG16在急性淋巴細胞白血病中被上調，其下調通過對hsa-miR-124-3p的相互作用，可能在白血病中發揮腫瘤抑制作用〔16〕。Cao等〔17〕分析了兒童急性髓細胞性白血病患者骨髓樣本中lncRNA的表達，發現與正常對照相比，兒童急性髓細胞性白血病中ENST00000415964下調了10倍以上。然而，對于ENST00000415964在白血病細胞增殖、周期和凋亡中作用知之甚少。本研究中32例急性白血病患者骨髓樣品中的ENST00000415964被下調，與Cao等〔17〕研究一致。本研究結果表明ENST00000415964可抑制白血病細胞的增殖，阻滯細胞周期，并且誘導細胞凋亡，顯示出一定的抗癌活性。

lncRNA通常通過充當miR的海綿，來抵消miR介導的下游靶標mRNA或信號通路的阻遏作用，從而發揮其生物學作用〔18〕。miR已被證明與白血病的發生和發展有關，可作為診斷和預后的新生物標志物，并成為白血病的潛在治療靶標〔19〕。據報道，miR-214在白血病患者中表達上調〔8〕，轉染miR-214抑制劑顯著上調第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)蛋白的表達并誘導慢性淋巴細胞白血病細胞的凋亡〔20〕。miR-214通過靶向ABCB1基因表達，調節慢性髓性白血病患者的甲磺酸伊馬替尼耐藥〔21〕。本研究發現miR-214與ENST00000415964存在靶向結合位點，提示ENST00000415964負調控miR-214的表達。功能實驗分析說明，lncRNA ENST00000415964通過靶向miR-214來調節白血病細胞的增殖、周期和凋亡。

miRNA參與細胞分化、增殖和凋亡，從而影響腫瘤的發生和發展〔22〕。miRNA通過結合靶mRNA的3′UTR，在ceRNA網絡中起著重要作用。生物信息學軟件分析表明，DKK3的3′UTR部分核苷酸序列可與miR-214形成互補配對。進一步使用熒光素酶報告試驗，證明DKK3是miR-214的潛在靶基因。據報道，DKK3位于染色體11p5.1，在多種腫瘤中表達下調，DKK3高甲基化導致其表達下調〔23〕。并且，在急性白血病患者中，DKK3表現出高甲基化，這可能是白血病重要的發病機制〔24〕。本研究結果表明，通過調節miR-214/DKK3途徑，ENST00000415964可以抑制白血病的發生發展。

綜上，lncRNA ENST00000415964在急性白血病患者中表達下調，具有抑制白血病細胞增殖、阻滯細胞周期和促進細胞凋亡的作用，并且其機制與靶向miR-214調控DKK3的表達有關。