腎茶袋泡茶質量標準的提升研究

王 劍 楊文玉 普天彪 李曉花,2*

1.西雙版納版納藥業有限責任公司，云南 景洪 666100；2.滇西應用技術大學 傣醫藥學院，云南 景洪 666100

腎茶為唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C. Y. Wu的全草，傣醫應用歷史悠久[1-2]?，F代藥理學和化學研究[3-4]顯示：腎茶中含有黃酮、二萜、酚類、三萜類等化學成分，具有抗炎、抗菌、利尿、免疫調節、改善慢性腎功能衰竭等藥理活性。腎茶袋泡茶(國藥準字Z20026660)由云南西雙版納版納藥業有限責任公司生產，是將腎茶切段粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥制得，具有清熱解毒、利水通淋的功效，用于膀胱濕熱所致的尿急、尿熱、尿痛，非特異性下尿路感染見上述證候者[5]。

腎茶袋泡茶質量控制的文獻報道較少，僅見王劍等[6]采用薄層色譜法對腎茶中熊果酸的含量進行了改進。腎茶袋泡茶現行質量標準WS-11108(ZD-1108)-2002中，包括薄層色譜的定性鑒別方法，采用HPLC法對熊果酸含量進行測定等方法[5]。根據文獻報道，迷迭香酸(RA)是一種天然存在的羥基化合物，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗菌作用和抗病毒的活性[7-8]，是腎茶主要有效成分之一，目前未見以腎茶袋泡茶中迷迭香酸作為含量測定指標的質量標準研究。本項目以腎茶袋泡茶的臨床應用為基礎，采用TLC法對腎茶袋泡茶進行定性鑒別，并建立腎茶袋泡茶中迷迭香酸的高效液相色譜法，以期使該制劑具備更好的質量可控性，使檢測標準更加全面和完善，提高現行質量標準。

A.腎茶生藥；B.腎茶藥材；C.腎茶袋泡茶圖1 腎茶圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；LC-2030型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；DFY-600D型粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；ZF-2三用紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；XMTD-701型薄層電動點樣器(上?？普苌萍加邢薰?ZDHW型調溫電熱套(河北省黃驊市中興儀器有限公司)；MS-105DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；DFY-600型搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；島津InertSustain C18液相色譜柱；Agilent 5 TC-C18液相色譜柱。

1.2 藥品與試劑 10批腎茶袋泡茶(西雙版納版納藥業有限責任公司，批號：160803、160805、170131、170901、170903、180610、180701、180704、180911、181004；規格：每袋裝3 g)；腎茶對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：121326-200502)；迷迭香酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號：111871-201706；純度：90.5%)；硅膠G薄層色譜板(青島譜科分離材料有限公司，批號：20200421)；純乙腈(Merk)和磷酸(J.T.Baker)為色譜純；鹽酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、甲酸等均為分析純試劑，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 外觀性狀 原標準對腎茶袋泡茶的性狀描述為“本品為袋泡茶，內容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”，缺少色澤描述，筆者對樣品進行觀察后，將腎茶袋泡茶的外觀性狀描述修改為“本品為袋泡茶，內容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”。

2.2 TLC鑒別[9-11]精密稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)粉末約1.0g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，回流提取60 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取迷迭香酸對照品，加30%甲醇超聲處理5 min，搖勻，制成50 μg /mL對照品溶液；30%甲醇作為陰性對照。照薄層色譜法 (通則 0502) 試驗， 吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5) 為展開劑展開，取出晾干，置紫外光燈 (365 nm) 下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。結果表明不同批次腎茶袋泡茶中均含有迷迭香酸。TLC色譜圖如圖2所示。

2.3 迷迭香酸的含量測定[8,12-15]

2.3.1 溶液制備 精密稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，稱定質量，回流提取60 min，放冷，再次稱定質量，30%甲醇補足減失質量，搖勻，過濾，取續濾液，得到供試品溶液。取迷迭香酸對照品10.79 mg，置50 mL容量瓶中，加30%甲醇適量，超聲處理5 min，加30%甲醇至刻度，搖勻，制成195.3 μg /mL對照品儲備液。乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)為陰性對照溶液。

1.腎茶對照藥材；2.迷迭香酸對照品；3.陰性對照(30%甲醇)；4～13號樣品

2.3.2 色譜條件 高效液相色譜儀：Agilent 1260和島津LC-2030；檢測器：紫外檢測器；色譜柱：島津InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.3 系統適用性及專屬性試驗 取陰性對照溶液(流動相)、對照品溶液和供試品溶液各適量，按照“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，結果顯示：腎茶袋泡茶中迷迭香酸的保留時間約為21.9 min，與其余色譜峰的分離度均大于1.5，基線分離度良好，陰性對照溶液在供試品和對照品色譜峰相應位置無干擾色譜峰，本方法系統適用性及專屬性良好。色譜圖如圖3所示。

2.3.4 線性關系考察 精密量取對照品儲備液 0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置25 mL容量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述制備的對照溶液10 μL注入液相色譜中，按“2.3.2”項下色譜條件進行檢測，測定峰面積，以進樣量(μg)橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。線形方程為Y=28988.0569967X+3434.4871968(r=0.9999)。迷迭香酸在3.906～78.12μg范圍內線性符合要求。結果如圖4所示。

A. 陰性對照；B. 對照品；C.樣品

圖4 迷迭香酸線性曲線圖

2.3.5 中間精密度試驗 精密稱取同一批的腎茶袋泡茶(批號180701)，采用Agilent1260高效液相色譜儀和島津LC-2030高效液相色譜儀，按“2.3.2”項下方法試驗，試驗結果表明，兩個型號高效液相色譜儀，兩個不同操作人員檢測結果分別為3.70mg和3.79mg，RSD分別為1.56%和1.45%，表明該方法中間精密度良好，結果符合要求。

2.3.6 重復性試驗 分別稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)，按照“2.3.1”項下制備方法獲得6個供試品，按“2.3.2”項下檢測方法測定迷迭香酸峰面積，計算質量分數，測定結果RSD為1.59%，重復性符合要求。

2.3.7 加樣回收試驗 取已知含量的供試品(批號：180701)9份，隨機分為3組，分別加入含有401.2 μg/mL的迷迭香酸對照品溶液4 mL、5 mL和7 mL后，加30%甲醇補充至20 mL，精密稱定，按“2.3.1”項下樣品溶液制備方法進行提取，按“2.3.2”項下檢測方法進行含量測定，結果表明：本法回收率在98.07%～101.45%之間。平均回收率為99.47%。結果符合要求。結果見表1。

表1 迷迭香酸回收率試驗

2.3.8 檢測限與定量限考察 檢測限和信噪比以3倍和10倍噪聲水平所相當的待測物質的量計算，按照“2.3.2”項下迷迭香酸的檢測方法對對照品溶液進樣檢測，結果迷迭香酸的檢測限為195.3 ng /mL，定量限為664.02 ng /mL。

2.3.9 穩定性試驗 取腎茶袋泡茶(批號：180701)樣品3份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，與對照品溶液分別于0、3、6、9、12、18、24 h測定，每個樣品3個重復，考察溶液穩定性，結果顯示：RSD為0.57%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.3.10 耐用性試驗 取三份樣品，按“2.3.1”項下方法進行樣品制備，選用Agilent 5 TC-C18色譜柱和島津InertSustain C18色譜柱，按“2.3.2”項下方法測定含量，比較不同廠家同型色譜柱對測定結果的影響。結果顯示，用島津InertSustain C18色譜柱和Agilent 5 TC-C18色譜柱所測的樣品含量均為3.55 mg/g，RSD分別為0.81%和0.96%，兩種品牌的色譜柱對迷迭香酸的含量測定結果無顯著影響，本方法耐用性良好。

2.3.11 樣品含量測定 按“2.3.2”項下檢測方法測定10批腎茶袋泡茶，迷迭香酸含量在8.13～11.54 mg/袋之間。平均含量為9.05 mg/袋。

表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測定結果 (n=2)

續表2 表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測定結果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 在薄層鑒定和含量測定試驗中，筆者分別考察了不同提取方法(超聲提取、回流提取)、不同提取溶劑(10%、30%、50%、70%和100%甲醇-水)、不同液料比(10、20、30、40、50倍50%甲醇)、不同提取時長(0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)對腎茶袋泡茶中迷迭香酸提取率的影響，并通過正交試驗進行了提取工藝優化。結果顯示，采用20倍30%甲醇，回流提取60 min，為腎茶袋泡茶中迷迭香酸的的最佳提取工藝。

3.2 質量標準性狀描述的改進 將原標準中腎茶袋泡茶的性狀“本品為袋泡茶，內容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”改為“本品為袋泡茶，內容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”，增加了色澤描述，使腎茶袋泡茶的性狀特征更完善。

3.3 質量標準中TLC鑒別項的改進 以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶4∶1)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸 (3∶10∶0.2)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸 -水(5∶4∶0.5∶0.5)、甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (2∶3∶4∶0.5∶2)、環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)，對展開劑進行了篩選，結果顯示：展開劑為環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸系統時，TLC圖譜中斑點清晰，分離度好。在方法學研究中，分別考察了溫度、濕度及不同廠家薄層板對迷迭香酸展開情況的影響，結果顯示，色譜斑點與分離度均符合要求，耐用性良好，確定環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)為腎茶袋泡茶的TLC鑒別條件。

3.4 HPLC含量測定方法的考察

3.4.1 流動相的選擇 通過查閱相關文獻資料，筆者主要考察了乙腈-0.1%乙酸(18∶82)，乙腈-0.1%乙酸(20∶80)和乙腈-0.1%乙酸(22∶78)等3種流動相對迷迭香酸出峰時間、峰形及樣品峰的影響。結果顯示，乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)為流動相，迷迭香酸的出峰時間為21.9 min左右、峰形呈正態分布、分離度好、樣品峰的純度最優。

3.4.2 流速的選擇 比較0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min下對迷迭香酸出峰時間、峰形等的影響。結果所示，流速為1.0 mL/min時，樣品中迷迭香酸的保留時間為21.9 min左右，與其他雜鋒分離度較好；流速越低，保留時間越長，流速快則影響迷迭香酸的分離度。綜合以上因素，選擇流動相的流速為1.0 mL/min。

3.4.3 柱溫的選擇 比較28 ℃、30 ℃和32 ℃ 3種柱溫條件對樣品中迷迭香酸含量測定結果的影響。結果顯示，不同溫度條件下所測的樣品含量范圍為3.81～3.94 mg/g，RSD為1.18%，符合要求，綜合考慮操作條件的可控性，選擇檢測柱溫為30 ℃。

3.4.4 檢測波長的選擇 色譜圖和光譜圖的檢測結果顯示，迷迭香酸在328 nm、330 nm和332 nm處均有吸收，檢測結果的RSD為0.76%，符合要求。當檢測波長為330 nm時，色譜圖基線更平穩、色譜峰分離度更好，靈敏度更高，因此確定檢測波長為330 nm。

3.5 含量限度的擬定 腎茶袋泡茶現行質量標準WS-11108(ZD-1108)-2002中，每袋腎茶以熊果酸(C30H48O3)計，含量不得少于2.4 mg。為了使腎茶袋泡茶質量標準更能與臨床應用相結合，本試驗采用HPLC法建立了腎茶袋泡茶中迷迭香酸的檢測方法。根據腎茶袋泡茶的處方(腎茶3000 g)和制法(切段，粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥，分裝，制成袋泡茶1000袋，即得)，本研究對10批腎茶袋泡茶進行檢測，迷迭香酸含量范圍為8.13～11.54 mg/袋。平均含量為9.05 mg/袋，根據10批產品的含量測定結果及《中國藥典》2015版四部通則9000制定原則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則七“原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%～120%”，以及公司對腎茶袋泡茶含量控制要求，暫定本品含量為平均含量的80%，即本品每袋含腎茶以迷迭香酸(C18H16O8)計，不得少于7.2 mg。

綜上，筆者在腎茶袋泡茶原有質量標準基礎上修訂了性狀描述，改進了TLC檢測條件，并采用HPLC法測定了迷迭香酸的含量，方法簡便可行，準確性、重復性高，能夠有效地提高腎茶袋泡茶的質量控制標準，為該制劑的臨床應用提供依據。