外源氯化鈣對鉛脅迫下水稻幼苗生長、SPAD值和熒光特性的影響

李雪梅， 黃禹翕， 蔡曉婧， 王銀茹， 代成龍

(沈陽師范大學生命科學學院，遼寧沈陽 110034)

鉛是典型的重金屬污染物，土壤中高濃度的鉛會直接或通過改變土壤中營養物質的微生物循環而破壞植物的生理結構。鉛通過富集在食物內傳遞給人，長期攝入會對神經、生殖等系統造成嚴重影響。有研究表明，鉛離子能夠與某些酶活性中心的金屬元素競爭，從而影響酶的正?；钚?，且能夠通過干擾植物的滲透調節物質降低葉綠素含量，破壞光合作用系統，造成生理生化過程的紊亂，影響植物生長。

利用外源物質提高植物幼苗的光合效率，增強植株的抗逆性已經在許多植物上得到應用。對植物來說，鈣離子是一種重要的礦質元素和信號物質，也是一種良好的膜保護劑，可以防止膜損傷，穩定其結構，保持膜的完整性。應用外源鈣可以減少環境脅迫，如干旱、鹽度和低溫對植物細胞膜的傷害，增強植物細胞膜穩定性和提高植物的抵抗力。

1931年Kautsky和Hirsch發現葉綠素熒光后，由于葉綠素熒光技術有著快速、無損的特點，得到了蓬勃發展，被廣泛應用于脅迫損傷等方面。目前，用于檢測植物葉綠素熒光的儀器主要有2種，一種是脈沖調制式熒光儀，通過測量光合作用中的光反應階段來反映光合作用中卡爾文循環等反應啟動后的光能捕獲、轉化和利用情況；另一種是連續激發熒光儀，主要是通過短時光照后熒光信號的瞬時變化表現暗反應前PSⅡ的光化學變化，得到快速葉綠素熒光動力曲線。2種儀器都在一定程度上可以反映葉綠素熒光的變化，但都具有一定的局限性，若能使用2種儀器進行測量并進行分析，反映出的結論將更加全面。

目前有很多關于重金屬脅迫對植物葉綠素熒光影響的研究，匡經舸等研究表明，鉛脅迫可以使洋常春藤的和qN升高，和ETR降低。祁金洋等研究表明，鉛脅迫降低了絹毛委陵菜/和/。但從葉綠素熒光角度探究外源氯化鈣對鉛脅迫的緩解作用相對較少。本研究采用水培法，通過噴施外源氯化鈣處理鉛脅迫下的水稻幼苗，利用2種葉綠素熒光儀研究外源氯化鈣對鉛脅迫后水稻幼苗葉綠素熒光相關指標的影響，旨在探究外源氯化鈣對鉛脅迫的緩解作用，從而為解決鉛脅迫對植物的影響提供新思路。

1 材料與方法

本試驗于2021年3月在沈陽師范大學大學生創新創業中心進行。

1.1 試驗材料與處理

1.1.1 水稻幼苗的培養 本試驗選用遼星1號水稻(L.)種子為試材。選取飽滿的水稻種子，經過漂洗、消毒后，放入恒溫培養箱30 ℃浸種24 h、催芽24 h，待種子露白后，將種子均勻地鋪在蓋有紗網的裝有霍格蘭(Hoagland)完全培養液的塑料燒杯中，每盆約100粒。后將種子放入人工培養箱(晝夜溫度28 ℃/25 ℃，光照黑暗16 h/8 h，相對濕度80%，光照度10 000 lx)中培養，每日補充營養液2次，待幼苗長至2葉1心期時，進行外施氯化鈣和鉛脅迫處理。

1.1.2 外施氯化鈣及鉛脅迫處理 將0、10、20、30 mmol/L CaCl噴施在水稻幼苗葉片，CaCl預處理24 h后，對水稻幼苗進行鉛脅迫模擬。將預處理后水稻幼苗換用含100 μmol/L Pb(NO)的Hoagland完全培養液培養。每個處理重復3次。

表1 外施氯化鈣及鉛處理

1.2 生長參數的測定

在鉛脅迫后的第5天從每個處理中隨機選擇10株幼苗測定其株高、根長和鮮質量。將稱完鮮質量的水稻幼苗樣品烘干至恒質量，測其干質量。

1.3 SPAD值的測定

在鉛脅迫后的第4天，從每個處理中隨機選8株幼苗葉片，用葉綠素含量測定儀(SPAD-502Plus，日本)在葉片的相同部位測定SPAD值。

1.4 快速葉綠素熒光動力曲線、葉綠素熒光參數和圖像的測定

1.4.1 快速葉綠素熒光動力曲線、基礎熒光參數、比活性參數和能量分配比率的測定 在鉛脅迫后的第4天，采用連續激發式熒光儀(Pocket PEA，英國)進行測定。每個處理隨機選取3株水稻，用暗處理夾夾住葉片的同一部位，關閉遮光片進行暗處理30 min后，得到快速葉綠素熒光動力曲線，測定基礎熒光參數，同時計算比活性參數和能量分配比率，參數及生物學意義見表2。

表2 基礎熒光參數、比活性參數及能量分配比率

1.4.2 熒光淬滅動力系數、熒光衰減率和圖像的測定 在鉛脅迫后的第4天，用脈沖調制式熒光儀(Fluorcam，捷克) 測定相關參數及圖像。從每個處理中隨機選取1株水稻的第2張葉，對其進行 15 min 暗處理后，測量光化學淬滅系數()和熒光衰減率()，在測量的同時，捕獲到CCD鏡頭下的實時熒光圖像，打開Flashes測量光，調整至清晰的圖像，得到最大PSⅡ光量子效率(/)和光化學淬滅系數()的圖像。

1.5 統計分析

采用Excel 2010處理數據并作圖，采用SPSS 22. 0對相關數據進行單因素方差分析(<0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗生長參數的影響

由表3可知，與CK相比，單鉛脅迫處理株高顯著下降(<0.05)，根長出現下降但不顯著；在噴施了氯化鈣后，株高較單鉛脅迫處理均有顯著上升(<0.05)，T2處理的根長比單鉛脅迫處理顯著增加，說明外源氯化鈣處理能夠減輕鉛在株高、根長上的影響。地上部和地下部鮮質量在單鉛脅迫后均出現了顯著降低(<0.05)，而在施加了氯化鈣后，各濃度處理均發生了顯著上升(<0.05)；對于干質量，各處理均未出現明顯變化。

表3 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗生長參數的影響

2.2 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗葉片SPAD值的影響

從圖1可以看出，水稻幼苗在單鉛脅迫下SPAD值出現了顯著下降(<0.05)，外施不同濃度的氯化鈣后，各氯化鈣處理較單鉛脅迫處理均顯著上升，但各濃度之間存在差異。其中，用10、20 mmol/L 氯化鈣處理上升十分明顯，接近CK；30 mmol/L 氯化鈣處理相較單鉛脅迫處理也發生顯著升高(<0.05)，但顯著低于10、20 mmol/L氯化鈣處理。

2.3 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗快速葉綠素熒光動力曲線的影響

如圖2-a所示，各處理均表現出標準的OJIP曲線形狀，單鉛脅迫處理的曲線I點、P點相比于CK組，均出現下降，說明鉛對水稻幼苗葉片造成了一定損傷；10、20、30 mmol/L氯化鈣處理的曲線I點和P點均出現上升，其中上升最明顯的是 20 mmol/L 氯化鈣處理，說明外源氯化鈣能夠緩解鉛對葉片反應中心活性的傷害。

對OJIP熒光曲線進行標準化后得到相對熒光變化曲線(圖2-b)，單鉛脅迫處理的J點明顯上升，說明電子從Q向Q的傳遞受到限制；施加氯化鈣后的各處理相比于單鉛脅迫處理J點熒光均出現下降，其中20 mmol/L氯化鈣處理下降程度最大，這表明氯化鈣處理減輕了鉛對電子傳遞的影響。

Δ代表K點的情況，K點表明放氧復合體(OEC)受到傷害的程度，由圖2-c可知，單鉛脅迫處理的Δ明顯上升，10、20、30 mmol/L氯化鈣處理的Δ均出現一定程度的下降，其中 20 mmol/L 氯化鈣處理下降程度最大，所以氯化鈣能夠減輕對OEC的損傷。

2.4 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗葉綠素熒光參數的影響

2.4.1 對葉綠素基本參數的影響反映暗適應后的最小熒光，是指植物充分適應黑暗后，光反應中心完全開放時獲得的熒光。由圖3可知，單鉛脅迫處理顯著高于CK，這說明鉛破壞了幼苗葉片的反應中心；而施加氯化鈣的各處理相比于單鉛脅迫處理出現了顯著降低(<0.05)。

表示暗適應后的最大熒光。由圖4可知，單鉛脅迫處理的顯著高于CK (<0.05)，施加氯化鈣后，均有所下降，但各濃度降低程度不同，10 mmol/L氯化鈣處理顯著降低，20、 30 mmol/L 氯化鈣處理組降低未達到顯著水平。

/代表植物體最大PSⅡ光量子效率，是反映植物抵抗逆境最具代表性的指標之一。由圖5可知，與CK相比，單鉛脅迫處理的/顯著下降(<0.05)，外施氯化鈣的各處理相比于單鉛脅迫處理顯著升高，但不同濃度間沒有特別明顯的差異。說明鉛對PSⅡ反應中心的損傷較為顯著，同時，氯化鈣能夠在一定程度上提高光能的轉換效率，減輕鉛脅迫帶來的損傷。

2.4.2 對熒光淬滅動力系數及熒光衰減率的影響 光化學淬滅系數()能體現PSⅡ激發能獲得的效率。如圖6所示，單鉛脅迫處理較CK顯著下降(<0.05)，而外施氯化鈣的各處理相比單鉛脅迫均發生了顯著上升，說明氯化鈣改變了鉛脅迫下水稻幼苗的能量轉換途徑。

是穩態熒光衰減率，經常被用來反映植物的活力狀態。如圖7所示，水稻受到鉛脅迫后，值相比于CK出現了顯著下降(<0.05)，在施加了氯化鈣后，各處理均有了明顯的上升(<0.05)，其中20 mmol/L氯化鈣處理的上升趨勢最明顯。這說明水稻受到鉛脅迫后，活力有所下降，同時氯化鈣能夠在一定程度上恢復水稻的活力。

2.4.3 對非活性參數的影響 由圖8可知，與CK相比，單鉛脅迫下ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC均出現了顯著升高(<0.05)。 這表明鉛脅迫使能量的分配方式和份額發生變化。在施加不同濃度的氯化鈣后，對于ABS/RC，10、20 mmol/L氯化鈣處理均發生了顯著降低(<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理沒有出現明顯降低。對于TRo/RC，10、20 mmol/L 氯化鈣處理的下降程度均達到顯著 (<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理沒有明顯降低。對于DIo/RC，10、20 mmol/L氯化鈣處理均發生了顯著下降(<0.05)；30 mmol/L氯化鈣處理變化不顯著。

2.4.4 對能量分配比率的影響 由圖9可知，與CK相比，單鉛脅迫下和均出現了顯著下降；出現了顯著上升 (<0.05)。這表明鉛脅迫使PSⅡ受體側的電子和量子傳遞、轉化均受到了一定影響。與單鉛脅迫相比，對于，10、20 mmol/L氯化鈣處理未發生明顯的升高，30 mmol/L氯化鈣處理出現了顯著降低(<0.05)；對于，10、20 mmol/L 氯化鈣處理的下降程度均達到顯著 (<0.05)，30 mmol/L氯化鈣處理沒有出現明顯的降低；對于，20 mmol/L氯化鈣處理上升顯著，30 mmol/L氯化鈣處理出現顯著下降(<0.05)，10 mmol/L氯化鈣處理未出現顯著變化。

2.5 外源氯化鈣處理對鉛脅迫下水稻幼苗葉綠素熒光圖像的影響

由圖10可以直觀地看出，對于/，單鉛脅迫處理的葉片整體上活性較低，特別是兩端部分所受傷害最為嚴重，而施加了氯化鈣的各處理，葉片活性升高，說明氯化鈣提高了水稻抵抗鉛脅迫的能力，這與Pocket PEA測量出的數據所反映的趨勢是一致的。對于，單鉛脅迫處理的葉片整體上活性較低，上部邊緣損傷極為明顯，而加入不同濃度的氯化鈣后，各組活性均出現一定的升高，這也說明施加氯化鈣后水稻幼苗的能量能夠被更有效的利用。

3 討論與結論

植物生長過程對鉛脅迫非常敏感，鉛脅迫會嚴重影響植物的生長發育，導致植物生物量減少，這與王馬勃等對茅蒼術的研究結果、李西等對草坪草的研究結果一致。本研究中，對水稻幼苗外施不同濃度的氯化鈣后，都在不同程度上增加了水稻幼苗的株高、根長、地上部和地下部鮮質量，這說明氯化鈣能夠減輕鉛脅迫對植物生長的抑制作用。

葉綠體是光合作用的重要場所，其葉綠素含量高低是植物光合能力高低的主要指標之一。SPAD值代表的是植物葉綠素的相對含量，本試驗表明單鉛脅迫降低葉綠素含量，而氯化鈣能夠增加SPAD值，從而促進水稻幼苗光合作用的進行。

葉綠素熒光誘導的快速動力學曲線含有豐富的關于PSⅡ反應中心的主要光化學反應的信息，對其分析提供了環境條件對光合作用機制影響的信息，主要是PSⅡ的供體側、受體側和反應中心。Pb脅迫處理OJIP曲線較CK組I點、P點下降、K點、J點上升，其中K點的出現表明囊泡所具有的膜流動性發生改變，導致PSⅡ復合物的穩定性下降，從而導致PSⅡ復合物的功能和結構完整性下降。在施加氯化鈣后，各處理組K點和J點下降且I點和P點出現不同程度的升高。這表現外源氯化鈣對PSⅡ供、受體側均起到了保護作用。

植物能夠通過刺激各種防御機制來應對生物和非生物脅迫，還能夠在面臨脅迫時迅速檢測外部刺激并產生和傳遞信號。鉛脅迫使和升高，這是由反應中心失活造成的，同時使/下降，表明造成了植物PSⅡ部分失活或傷害。在外施氯化鈣后，和值下降，/出現上升，這反映出氯化鈣能夠提高水稻幼苗的抗鉛脅迫的能力，恢復反應中心活性。此外，2種儀器測量的數值和圖像均反映出相同的趨勢。

植物在正常條件下吸收的光能主要在3個步驟中消耗：光合作用電子轉移、葉綠素熒光發射和散熱。 這3種途徑之間又存在此消彼長的關系，所以通過測定熒光變化可以了解光合作用和熱耗散的情況。反映了原初反應中原初電子受體的還原情況和PSⅡ開放的程度，所代表的是穩態熒光衰減率。本試驗中，鉛脅迫顯著降低了和，說明鉛脅迫改變了光能的消耗途徑，PSⅡ開放的程度降低，植物活力下降，能量可能更多以熱能的形式散失。對于施加氯化鈣的各組，和的數值均有一定的升高，說明水稻幼苗的能量更多地被有效利用，植物體活性有所提高。

比活性參數反映的是卡爾文循環開始前，植物體能量吸收、轉化、傳遞和利用的過程。、和表現了PSⅡ受體側能量分配的比率。單鉛脅迫下ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均顯著升高，和數值均出現了顯著下降，說明鉛改變了能量的利用方式和份額，更多的能量以熱能的形式被消耗，從而降低了用于傳遞電子的能量比例。對于外施10、20 mmol/L氯化鈣組的ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC和均顯著下降，和數值上升，且2組趨勢較為一致，這表明外施氯化鈣處理在能量運動方式上明顯區別于單鉛脅迫組，在一定程度上改善鉛對于能量運動方式的影響，被有效利用的能量更多，從而促進水稻幼苗的正常生長和光合作用；30 mmol/L氯化鈣處理組相比于單鉛脅迫組ABS/RC、TRo/RC、DIo/RC差別不大，升高更多，和降低更為明顯，這可能是由于鈣離子濃度過高對鉛脅迫水稻幼苗的傷害造成了近一步傷害。

通過以上結果可以看出，外源氯化鈣可以有效降低鉛脅迫對水稻幼苗生長的抑制，提高鉛脅迫下水稻幼苗SPAD值、光能利用效率。這主要是外源氯化鈣提高了水稻幼苗光合電子傳遞效率，對PSⅡ反應中心起到保護作用，在一定程度上緩解了鉛脅迫對水稻PSⅡ的傷害。其次，綜合來看，外施10、20 mmol/L CaCl處理效果更理想。綜上，適宜濃度的外源氯化鈣能夠在一定程度上對鉛脅迫下的水稻幼苗起到緩解作用，從而能夠為減輕鉛對植物的傷害提供理論依據，為解決鉛對于農業方面的影響提供新思路。