龍膽瀉肝丸中木通的鑒別研究

周云峰，謝婷，鄧杰華，李存金，楊建冬，黃炳泉

1.宜春市檢驗檢測中心，江西 宜春 336000；2.宜春市人民醫院，江西 宜春 336000；3.江西省藥品檢查員中心，江西 南昌 330000

龍膽瀉肝丸（水丸）的原處方含有關木通，收載于《中國藥典》2000 年版一部［1］，由于龍膽瀉肝丸腎毒性事件［2］，2003 年國家藥品監督管理局取消了關木通（含馬兜鈴酸）的藥用標準，并責令把龍膽瀉肝丸處方中的關木通更換為木通（木通科），現收錄于《中國藥典》2020 年版一部［3］。然而，現行藥典標準沒有對龍膽瀉肝丸方中木通的質量進行控制，難以知悉木通投料的真實情況，加上市場仍存在關木通、川木通等混淆作木通使用的情況［4-7］，這可能會對含有木通藥味的中藥復方制劑的質量帶來較大風險?；诖?，為了有效保證龍膽瀉肝丸安全、有效、質量可控，本研究采用超高液相串聯質譜技術建立龍膽瀉肝丸中木通的定性鑒別方法，為提升龍膽瀉肝丸的質量標準、進一步控制制劑的整體質量提供實驗參考和技術支撐。

1 儀器與試藥

超高液相色譜-質譜聯用儀（美國waters 公司，液相儀型號：H-class，質譜儀型號：xevo TQD）；MS205DU 電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；TLE 204E 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；PL-S60 超聲波清洗儀（東莞康士潔超聲波科技有限公司）。

龍膽瀉肝丸（共抽取市售產品36 批，均為水丸，涉及17 個生產廠家，36 個批號，4 個規格：每100粒重6 g、每袋裝6 g、60 g/瓶、每袋裝3 g）；木通對照藥材（批號：201101，來源于湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，由本中心楊建冬主任中藥師鑒定）；川木通對照藥材（批號：121409-202003，中國食品藥品檢定研究院）；關木通對照藥材（批號：DST201219-072，成都德思特生物技術有限公司）；甘木通對照藥材（批號：121443-201102，中國食品藥品檢定研究院）；木通苯乙醇苷B 對照品（批號：111910-201604，純度98.2%，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（質譜級，德國默克股份兩合公司）；甲酸（質譜級，賽默飛世爾科技有限公司）；甲醇（色譜級，西格瑪奧德里奇貿易有限公司）；水（蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結果

2.1 檢測條件

液相條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相乙腈A 和0.1%甲酸溶液B（梯度洗脫程序：0～13 min，90%～25% B；13～15min，25% B；15.01～17 min，90% B），流速0.2 mL/min，進樣量2 μL，柱溫30 ℃；質譜條件：電噴霧離子源（ESI-），溫度150 ℃，子離子掃描模式，母離子m/z 477［M-H］-，掃描范圍60～600 m/z，質譜采集數據時間0～10 min，毛細管電壓0.5 kV，錐孔電壓-55 V，碰撞電壓30 V，錐孔氣流量50 L/h，脫溶劑氣流量900 L/h，脫溶劑氣溫度550 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液精密稱取木通苯乙醇苷B 對照品適量，加70%甲醇溶液溶解稀釋成約0.5 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液樣品研細，取約1 g，精密稱定，置于100 mL 量瓶中，加入70%甲醇溶液約80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）60 min，放冷，加70%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 對照藥材溶液取木通、川木通、甘木通和關木通對照藥材各0.1 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項下供試品溶液的處理方法制備對照藥材溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液方中各藥味均以原粉入藥，按照處方比例，制備缺木通藥味的龍膽瀉肝丸陰性樣品粉末，取約1 g，精密稱定，再按“2.2.2”項下供試品溶液的處理方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性

取陰性樣品溶液、對照藥材溶液、木通苯乙醇苷B 對照品溶液和供試品溶液各2 μL，按2.1項下檢測條件依次進行測定，子離子掃描的總離子流圖（TIC）見圖1。結果表明，市售樣品溶液的一級質譜出現與木通苯乙醇苷B 對照品溶液、木通對照藥材溶液保留時間一致的色譜峰，而陰性樣品溶液、川木通對照藥材溶液、關木通對照藥材溶液和甘木通對照藥材溶液均未檢出與木通苯乙醇苷B 對照品溶液保留時間一致的色譜峰，說明陰性樣品溶液對檢測無干擾，且川木通、關木通和甘木通不含有木通的特征性成分木通苯乙醇苷B，專屬性良好。

圖1 各溶液EIC提取離子流圖：A.陰性樣品；B.川木通；C.關木通；D.甘木通；E.木通；F.木通苯乙醇苷B對照品；G.供試品

2.4 樣品結果

取36 批水丸樣品，制成供試品溶液后，按“2.1”項下檢測條件測定。結果可知，所有樣品的一級質譜均檢出與木通苯乙醇苷B 對照品溶液保留時間一致的色譜峰，且樣品的二級質譜的主要碎片離子為315、281、179、161、135、119 和89，與木通苯乙醇苷B 對照品和木通對照藥材的主要碎片離子一致，說明所抽取的龍膽瀉肝丸樣品均含有木通苯乙醇苷B 成分。

3 討論

液相色譜串聯質譜法具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好、專屬性強等特點，被廣泛用于藥品非法添加成分檢查及中藥復方制劑中藥味的定性和定量分析［8-13］。木通苯乙醇苷B 是木通的特征性定量成分［3,14-15］，本研究嘗試采用液質聯用技術對其進行快速鑒別分析，采用了子離子掃描檢測模式，同時采用正、負離子切換模式測試，發現采用負離子模式，木通苯乙醇苷B 具有較高的質譜響應。

方法的耐用性試驗，主要對不同色譜柱、不同溫度和不同流速進行了考察。色譜柱使用了Waters 公司的Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱和Waters ACQUITY UPLC CSH C18 柱；溫度設定了25 ℃、30 ℃和35 ℃三個溫度；流速測試了三種（0.2 mL/min、0.25 mL/min 和0.3 mL/min）。結果顯示不同色譜柱、不同溫度和不同流速對測定結果無影響，只會影響目標化合物的出峰時間。

水丸樣品處方中各藥味均以原粉入藥，木通投料占比量約為7.1%，稱取1.0 g 左右的樣品約相當于0.1 g 的木通原料。為了考察川木通、關木通和甘木通中是否含有木通的特征性化學成分木通苯乙醇苷B，川木通、關木通和甘木通對照藥材各稱取約0.1 g，以水丸樣品相同的處理方法制備對照藥材溶液進行測定比較，結果顯示川木通、關木通和甘木通對照藥材均未檢出木通苯乙醇苷B，而市售樣品和木通對照藥材均可檢出，說明所建方法能夠對樣品中木通進行準確定性分析，可有效甄別是否有混淆品冒充替代木通進行投料，可作為龍膽瀉肝丸中木通質量的控制方法。