桂花新品種‘胭脂紅’不同發育階段花瓣非靶向代謝組學分析

柴子涵，張 敏，李 嵐，張 成，段一凡*

(1.南京林業大學 生物與環境學院，南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；2.木犀屬植物栽培品種國際登錄中心，江蘇 南京 210037)

桂花學名木犀(Osmanthusfragrans)，隸屬于木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)，既是優良的園林綠化樹種，也是著名的香花植物[1]。桂花是我國傳統十大名花之一，有著2 500 a以上的栽培歷史[2]。在長期的栽培過程中，人們選育出了豐富的桂花品種。前人根據花期、花色、結籽與否、葉色等觀賞性狀特征，將桂花分為5大品種群：四季桂品種群(Asiaticus Group)、銀桂品種群(Albus Group)、金桂品種群(Luteus Group)、丹桂品種群(Aurantiacus Group)以及彩葉桂品種群(Colour Group)[3-4]。雖然在長期的馴化過程中，桂花形成了黃白色—黃色—橙黃色的不同顏色梯度的品種，但顏色較為單一，缺少其他色系的品種[5]。2014年桂花新品種‘胭脂紅’通過木犀屬植物栽培品種國際登錄中心的實質審查，該品種初開時呈淡黃色，后逐漸呈胭脂紅色[6]。因其獨特的花色，‘胭脂紅’填補了紅色系桂花品種的空白。

代謝組學是研究生物體某階段各種小分子代謝產物變化的理想技術手段，主要可以分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學[7]。靶向代謝組學利用前期建立的代謝物數據庫，可以對目標代謝物進行絕對定量分析[8]。雖然靶向代謝組學有著準確度高、特異性強的特點，但非靶向代謝組學可以全面分析生物體內代謝物的種類，無差別篩選代謝物，最終可以最大限度和最大范圍檢測生物體中的代謝物變化情況[9]。因此，本研究以不同發育階段的‘胭脂紅’花瓣為材料，利用非靶向代謝組學分析其代謝物種類和含量的時序性變化，以期探尋該品種所含特殊的代謝物及其合成積累規律，為挖掘‘胭脂紅’的潛在價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

‘胭脂紅’采自浙江省金華市華安園林苗木基地(119°38′42.57″E，28°58′15.51″N)。根據花瓣的外部特征和顏色變化，確定了3個具有代表性的發育階段(圖1)。采集初花期(S1)、盛花期(S2)和末花期(S3)花瓣，液氮速凍后-80 ℃保存，每個發育階段樣品重復3次。

注：A.初花期(S1)；B.盛花期(S2)；C.末花期(S3)。圖1 不同發育階段‘胭脂紅’Fig.1 Different developmental phases of Osmanthus fragrans‘Yanzhi Hong’

1.2 代謝物提取方法

首先將樣品冷凍干燥處理，利用SCIENTZ-48組織研磨儀(新芝，中國)進行研磨(55 Hz，60 s)；精確稱量100 mg研磨后的樣本至2 mL EP管中，加入0.6 mL含內標的甲醇(67-56-1，99.0%，Thermo Fisher)，渦旋振蕩30 s；冰水浴中超聲15 min，4 ℃過夜后，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；取上清液，0.22 μm膜過濾后進行LC-MS上機檢測[10]。

1.3 上機檢測及相關參數設置

使用UltiMate 3 000液相色譜儀(Thermo Fisher，美國)對樣品進行分離。色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm(2.1×150 mm)色譜柱(Waters，美國)，柱溫設為40 ℃，自動進樣器溫度設為8 ℃，進樣體積為2 μL。正離子流動相A為體積分數0.1%的甲酸(64-18-6，LC-MS級，TCI)—水溶液，流動相B為體積分數0.1%的甲酸—乙腈(75-05-8，99.9%，Thermo Fisher)溶液；負離子流動相A為5 mmol/L甲酸銨(540-69-2，99.9%，Sigma)—水溶液，流動相B為乙腈[11]。

使用Q Exactive Plus質譜儀(Thermo Fisher，美國)進行質譜數據采集。正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV。毛細管溫度為325 ℃，以分辨率70 000進行全掃描，掃描范圍為81～1 000。采用HCD進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態排除去除無必要的MS/MS信息[12]。

1.4 數據預分析

通過Proteowizar(v3.0.8789)將獲得的原始質譜數據轉成mzXML格式，使用R(v4.1)的XCMS包進行峰識別、峰過濾和峰對齊等處理，主要參數設定為bw=2、ppm=15、peakwidth=c(5,30)、mzwid=0.015、mzdiff=0.01、method=centWave[13]。

1.5 代謝物相對定量與鑒定

本研究基于UPLC/HRMS進行代謝組學的相對定量分析。該方法首先獲取標準曲線校正溶液和樣本溶液的原始質譜數據，然后計算標準曲線校正樣品和正負離子模式下鑒定到的同位素峰面積，并與標準曲線的校正濃度進行線性擬合，優選線性方程和同位素內標。再將樣本中代謝物峰面積與標準曲線校正溶液中優選的同位素內標峰面積的比值，代入優選的線性方程，計算樣本中代謝物的相對定量濃度。將代謝物精確分子量，以及MS/MS模式所得碎片信息在Metlin(http://metlin.scripps.edu)、MoNA(https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu)和自建標準品數據庫中進一步匹配注釋，獲得代謝物準確信息[14]。

1.6 數據分析

依據不同階段代謝物的相對含量，使用R(v4.1)的Mfuzz包對代謝物進行聚類分析[15]。利用KEGG(http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html)和R(v4.1)的ggplot2包對代謝物進行KEGG富集分析[16-17]。使用Excel 2016對數據進行整理，使用SPSS(v23.0)對數據進行ANOVA分析。

2 結果與分析

2.1 ‘胭脂紅’不同發育階段代謝物種類

經過篩選，正離子模式共獲得5 519個前體分子，負離子模式共獲得7 010個前體分子。共注釋到304個代謝物，包括64種醇和多元醇、9種苯二酚、15種單萜類化合物、15種二元羧酸及其衍生物、18種吡啶甲酸及其衍生物、64種氨基酸、18種羰基化合物、37種脂肪酸及其復合物、46種碳水化合物及其復合物和18種苯甲酸及其衍生物。

2.2 ‘胭脂紅’不同發育階段代謝物聚類分析

為了進一步分析‘胭脂紅’發育過程中代謝物的相對含量變化，本研究對所注釋到的代謝物進行聚類分析，具有相同積累規律的代謝物會被聚到同一個簇中(圖2)。所有的代謝物被聚成9個簇，大致可以分為4種類型：持續上調(Cluster 6、Cluster 9)、持續下調(Cluster 8)、先上調后下調(Cluster 3、Cluster 5、Cluster 7)、先下調后上調(Cluster 1、Cluster 2、Cluster 4)。

注：S1.初花期；S2.盛花期；S3.末花期。圖2 ‘胭脂紅’不同發育階段代謝物聚類圖Fig.2 Clustering map of metabolites in different developmental phases of ‘Yanzhi Hong’

Cluster 6顯示，24個代謝物的相對含量在開花過程中呈現上升趨勢，且S1時期至S2時期的上升趨勢明顯，S2時期至S3時期的上升趨勢平緩。其中，相對含量較高的代謝物有3-羥基苯乙酸、3-羥基丁酸、L-酪氨酸和山楂酸等。Cluster 9顯示，42個代謝物的相對含量在開花過程中呈現上升趨勢，且S1時期到S2時期的上升趨勢平緩，S2時期到S3時期的上升趨勢明顯。其中，相對含量較高的代謝物有2-脫氫-3-脫氧-D-阿拉伯糖酸、D-木糖醇、異丁酸、L-2-羥基戊二酸和檸檬酸等。

Cluster 8顯示，41種代謝物的相對含量在開花過程中呈現下降趨勢，S2時期至S3時期的下降趨勢較S1至S2時期幅度大。其中，相對含量較高的代謝物有琥珀酸、乙基丙二酸、茉莉酮酸甲酯、3-甲基-2-氧代戊酸、馬來酸、β-谷甾醇、紅景天苷、苦杏仁苷、咖啡酸和長葉薄荷酮等；該簇包含紅景天苷和苦杏仁苷等環烯醚萜。

Cluster 3顯示，32種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先下降后上升趨勢，且代謝物在S3時期相對含量最高。其中，相對含量較高的代謝物有紫蘇醇、γ-氨基丁酸、庚二酸、肉豆蔻酸和鼠尾草酚等；該簇包含連翹酯苷E和5-O-甲基維斯阿米醇苷等環烯醚萜。Cluster 5顯示，34種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先下降后上升趨勢，且代謝物在S3時期相對含量最高。其中，相對含量較高的代謝物有D-果糖、苯乙酸、反式-肉桂酸、氧化檸檬烯、乙酸苯酯、檸檬酸和月桂酸等。Cluster 7顯示，28種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先下降后上升趨勢，且代謝物在S1時期相對含量最高。其中，相對含量較高的代謝物有β-丙氨酸、焦谷氨酸、氧戊二酸、己二酸二辛酯、琥珀酸半醛、3-氨基戊二酸、富馬酸和連翹酯苷等，該簇包含連翹酯苷和大車前苷等環烯醚萜。

Cluster 1顯示，36種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先上升后下降趨勢，且S3時期代謝物的相對含量較S1時期高。其中，相對含量較高的代謝物有異纈草酸、3-脫氫莽草酸甲酯、桃葉珊瑚苷和棕櫚酸等；該簇包含桃葉珊瑚苷這一環烯醚萜。Cluster 2顯示，37種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先上升后下降趨勢，且S1時期代謝物的相對含量與S3時期相對持平。其中，相對含量較高的代謝物有、L-異亮氨酸、3-甲基-2-氧戊酸、L-賴氨酸、4-羥基肉桂酸、吲哚丙酮酸、甜菜堿和綠原酸等。Cluster 4顯示，29種代謝物的相對含量在開花過程中呈現先上升后下降趨勢，S1時期至S2時期的上升趨勢平緩，但S2時期至S3時期的下降趨勢明顯。其中，相對含量較高的代謝物有3,4-二羥基苯基丙酸酯、醉椒素、薄荷酮、金雀異黃酮和硬脂酸等；該簇包含金雀異黃酮這一黃酮類物質。

2.3 不同聚類代謝物的代謝通路分析

利用 KEGG 數據庫信息來分析‘胭脂紅’不同聚類代謝物所在的生物學通路。持續上調的聚類中，Cluster 6中的代謝物共映射到35條代謝通路，其中富集程度顯著的有苯丙氨酸代謝途徑，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑(圖3-A)。Cluster 9富集程度顯著的有抗壞血酸和藻酸鹽代謝途徑以及乙醛酸和二羧酸的代謝途徑。持續下調的聚類中，Cluster 8中的代謝物共映射到30條代謝通路，其中富集程度顯著的有丁酸甲酯代謝途徑，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑以及檸檬酸循環(TCA循環)途徑(圖3-B)。先下調后上調的聚類中，Cluster 3中富集程度顯著的有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑；Cluster 5中富集程度顯著的有苯丙氨酸代謝途徑和α-亞麻酸的代謝途徑；Cluster 7中的代謝物共映射到19條代謝通路，其中富集程度顯著的有丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，嘧啶代謝途徑以及酪氨酸代謝途徑(圖3-C)。先上調后下調的聚類中，Cluster 1中富集程度顯著的有戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化途徑以及光合生物中的碳固定途徑；Cluster 2中富集程度顯著的有β-丙氨酸代謝途徑；Cluster 4中的代謝物共映射到22條代謝通路，其中富集程度顯著的為類單萜的生物合成途徑(圖3-D)。

注：A.Cluster 6；B.Cluster 8；C.Cluster 7；D.Cluster 4；點的大小代表代謝物個數，顏色代表P值。圖3 不同聚類中代謝物的KEGG富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of metabolites in different clusters

2.4 ‘胭脂紅’不同發育階段香氣成分分析

桂花是重要的木本香花植物，而‘胭脂紅’有著獨特的香氣，所以本研究也特別關注了其香氣成分在不同發育階段的動態變化。所測代謝物中共有34種與花香有關的香氣成分(表1)，主要分為醇類、酮類、萜烯類、酸類和酯類等。各類香氣成分的種類在不同發育階段的差異較小，但是相對含量有著顯著差異。

表1 不同發育階段香氣成分的相對含量Table 2 Relative content of aroma components in different developmental phases %

‘胭脂紅’在不同發育階段香氣成分的相對含量不同。S1時期檢測出的香氣成分相對含量最高的是紫蘇醇，較高的有3,4-二羥基苯丙酸酯、茉莉酮酸甲酯、香葉酸、己二酸二乙基己酯和胡薄荷酮；S2時期檢測出的香氣成分相對含量最高的是紫蘇醇，較高的有3,4-二羥基苯丙酸酯、4-羥基苯甲酸酯、茉莉酮酸甲酯和順式-己二烯二酸酯；S3時期檢測出的香氣成分相對含量最高的是紫蘇醇，較高的有香葉酸和10-氧癸酸酯。整體來看，相對含量最高的香氣成分是紫蘇醇，較高的有3,4-二羥基苯丙酸酯、香葉酸、茉莉酮酸甲酯、順式-己二烯二酸酯和氧化檸檬烯等。

不同香氣成分的相對含量積累規律也有很大區別。紫蘇醇、香葉酸、鼠尾草酚、肉豆蔻酸、10-羥基硬脂酸、氧化檸檬烯、乙酸苯酯、月桂酸和反式-肉桂酸等的相對含量先降低再升高；順式-己二烯二酸酯、棕櫚酸、石竹烯α-氧化物、L-香芹酮、L-薄荷酮、硬脂酸和γ-萜品烯等的相對含量先升高再降低；茉莉酮酸甲酯、胡薄荷酮、咖啡酸和亞麻酸等的相對含量不斷降低；只有10-氧癸酸酯的相對含量在發育過程中持續升高。

3 結論與討論

本研究基于非靶向代謝組，解析了‘胭脂紅’花瓣在初花期、盛花期和末花期3個階段的代謝組學動態變化規律。通過代謝物定性定量分析和聚類分析，首次在桂花中檢測到了6種環烯醚萜和1種黃酮，且具有很高的藥用價值。共測得34種香氣成分，含量最高的是紫蘇醇，其次是3,4-二羥基苯丙酸酯、香葉酸和茉莉酮酸甲酯等。對不同聚類中的代謝物進行富集分析，富集到與花香有關的苯丙氨酸代謝途徑和α-亞麻酸代謝途徑，以及與花色有關的單萜生物合成途徑。

通過聚類分析，大致將代謝物的時序性變化歸為4類：持續上調、持續下調、先上調后下調和先下調后上調。本研究首次在桂花中檢測到了6種環烯醚萜和1種黃酮，包括苦杏仁苷、連翹酯苷E、5-O-甲基維斯阿米醇苷、連翹酯苷、大車前苷、桃葉珊瑚苷和金雀異黃酮。從S1到S3，苦杏仁苷的相對含量逐漸降低，連翹酯苷E、5-O-甲基維斯阿米醇苷、連翹酯苷和大車前苷的相對含量先下降后上升，桃葉珊瑚苷和金雀異黃酮的相對含量先上升后下降。以上所檢測到的環烯醚萜和黃酮類物質，具有廣泛的抗氧化活性和藥理作用。Zhang等[18]研究發現苦杏仁苷可以治療呼吸系統疾病、改善各種肺病引起的肺損傷。韓彥琪等[19]發現連翹酯苷E、咖啡酸等化學成分通過作用于關鍵蛋白，干預了多個與清熱解毒相關的生物過程，從而對COVID-19具有一定的治療作用。崔佳瑩等[20]總結，金雀異黃酮具有抗氧化、抗腫瘤、保護心血管、防治骨質疏松等藥理作用，并能協同化療藥物提高化療的效果。Sun等[21]發現5-O-甲基維斯阿米醇苷通過降低炎癥因子的含量，有效地逆轉脂多糖LPS誘導的小鼠抑郁樣行為。通過前人的研究，可以發現‘胭脂紅’花瓣中的這類代謝物具有很高的藥用價值，這表明‘胭脂紅’作為桂花的新品種，其所含的化學成分也有進一步挖掘和利用的價值。

桂花是重要的香花樹種，且‘胭脂紅’有著獨特的香氣，所以本研究也特別關注了其香氣成分的組成。將本研究所測得的34種香氣成分的相對含量進行比較分析，結果表明相對含量最高的是紫蘇醇，其次是3,4-二羥基苯丙酸酯、香葉酸和茉莉酮酸甲酯等。施婷婷等[22]比較分析‘波葉銀桂’、‘雨城丹桂’和‘日香桂’的香氣成分，發現這3個品種的香氣成分都以芳樟醇及其氧化物、紫羅蘭酮等烯萜類物質為主，但未測出紫蘇醇、香葉酸和茉莉酮酸甲酯等。然而，張雪松等[23]通過對金桂浸膏的香氣成分進行分析，結果包含了本研究所測的‘胭脂紅’花瓣的部分成分，比如紫蘇醇、香葉酸、棕櫚酸、亞麻酸和硬脂酸等。綜合以上研究結果，‘胭脂紅’有著特殊的香氣成分組成，推測可能與品種、栽培條件和試驗方法等多種因素有關。這個推論與張靜等[24]對不同品種牡丹香氣成分分析的結論是一致的。

通過KEGG富集分析，本研究富集到了與花香有關的苯丙氨酸代謝途徑和α-亞麻酸代謝途徑，以及與花色有關的單萜生物合成途徑。苯丙氨酸代謝途徑的底物苯丙氨酸，在苯丙氨酸解氨酶的催化下生成反式-肉桂酸，反式-肉桂酸再經過一系列甲基化、?；绕渌磻煽Х人岬雀黝惙枷阕寤衔颷25]。然而咖啡酸等香氣成分的積累規律與反式-肉桂酸差異較大，推測與該通路中其他關鍵基因的表達量有關。單萜生物合成途徑的底物牻牛兒基焦磷酸(GPP)是萜類骨架生物合成途徑的中間產物，其在四異戊二烯焦磷酸合成酶(GGPS)的催化下生成類胡蘿卜素生物合成通路的底物牻牛兒基牻牛兒焦磷酸(GGPP)[26]。韓遠記[27]研究表明，桂花花瓣中色素主要是類胡蘿卜素，加之‘胭脂紅’花瓣顏色在S2時期開始加深，本研究推測S2時期類胡蘿卜素生物合成有關基因表達量較高，導致類單萜生物合成途徑在S2時期表達量較低。

以上推測需要后續進行轉錄組學的分析來驗證。下一步研究中，可以將代謝組學和轉錄組學相結合，進一步分析特殊藥物化學成分和香氣成分的分子基礎，解析特殊花色形成的代謝通路，為更好地挖掘和利用‘胭脂紅’的藥用價值，以及通過分子手段改良桂花的花色、花香提供理論依據。