不同谷物培養基質對蛹蟲草有效成分的影響

錢朋智，張梅娟，王韜，郭宏文，王艷菊，甄珍

（1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省哈爾濱市海關技術中心齊齊哈爾綜合實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link.]，又名北蟲草、北冬蟲夏草，為子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌，是重要的食藥兩用真菌，可與冬蟲夏草相媲美。在我國，蛹蟲草目前已大規模種植，廣泛分布于廣東、山東、遼寧、吉林等地[1]。2009年我國衛生部正式將蛹蟲草批準為新資源食品，2014年更名為“新食品原料”[2]。

蛹蟲草含有蟲草素、蟲草多糖、麥角甾醇和纖溶酶等多種天然生物活性物質[3-4]。蟲草素是核苷類物質，其含量是衡量蛹蟲草質量的標準之一[5-7]；此外，蟲草素具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調節、清除自由基等多種藥理作用[8]；有研究發現，蛹蟲草中含有蟲草素和噴司他丁兩種獨特的有效成分，是冬蟲夏草的良好替代品[3，9]。蟲草多糖是主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖等組成的多聚糖，是蛹蟲草活性物質中重要的物質，具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等作用[1，10]。麥角甾醇是微生物細胞膜的重要組成部分，是具有生物活性的化合物；蛹蟲草麥角甾醇在抑菌、降脂、防腫瘤、免疫調節等方面具有顯著功效[11-12]。纖溶酶是能專一降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶，蛹蟲草纖溶酶具有溶栓抗脂等生物活性功能[2，13]。

作為一種“新食品原料”，蛹蟲草的營養和保健功能越來越受到人們的認可[14]，而對其活性成分進行評價能更好地反映其內在品質。谷物是培養蛹蟲草的原料之一，具有來源廣泛、價格低廉、質量可靠等優點。不同谷物的營養成分和理化性質有一定差異，培養所得的蛹蟲草菌絲共生體或子實體中功能成分含量不同。目前，人工栽培的蛹蟲草子實體大多選用大米、小麥等培養基質，固體基質較單一，且目標多為提高子實體中的蟲草素含量，對其他活性物質如粗多糖、麥角甾醇和纖溶酶的研究相對較少；而且市場上蛹蟲草的活性成分差異較大，對蛹蟲草產業的發展造成了一定的影響[1]。培育蛹蟲草菌絲共生體或子實體的目的：一是直接用于產品的開發制備，二是對蛹蟲草培養過程中產生的代謝產物進行提取和利用。培養含有特定活性物質和功能的蛹蟲草產品，是蛹蟲草產業發展的必然趨勢。而合適的培養基對蛹蟲草菌絲共生體或子實體的生長及活性物質的合成具有促進作用。因此，本研究以高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]、糜子（Panicum miliaceum L.）和油莎豆（Cyperus esculentus L.）3 種谷物為培養基質，接種蛹蟲草液體菌種，檢測不同培養基質中蛹蟲草菌絲共生體和子實體的主要有效活性成分含量，以期為蛹蟲草優良品質以及產品開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、糜子、油莎豆（均為食品級）：產于齊齊哈爾市泰來縣；蛹蟲草斜面菌種（母種）：齊齊哈爾大學食品與生物工程學院微生物研究室。

蟲草素標準品（≥98%）、麥角甾醇標準品（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；苯酚、高錳酸鉀、葡萄糖、濃硫酸（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；草酸、甲醇、乙醇（均為色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；牛血纖維蛋白原、牛凝血酶（500 U/mL）：中國醫學科學院天津血液研究所。

谷物培養基質的配制：分別向耐高溫（140℃）高壓玻璃罩栽培器中添加高粱、糜子和油莎豆各100 g，并添加適量水，121℃高壓0.1 MPa滅菌1 h，冷卻至25℃備用。

液體菌種培養基的配制：稱取馬鈴薯20 g，加水100 mL，在加熱器上加熱至沸騰，用紗布進行過濾。向濾液中加入葡萄糖2 g，定容至100 mL，121℃高壓0.1 MPa滅菌15 min，冷卻至25℃備用。

1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX）：上海申安醫療器械有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9243BS-Ⅲ）：上海新苗儀器有限公司；多功能小型粉碎機（J-02）：上海淀久中藥機械制造有限公司；超聲波清洗器（Q-600B）：昆山市超聲儀器有限公司；臺式離心機（TDL-80-2B）：上海安亭科學儀器廠；超純水制備儀（Millipore）：密理博有限公司；紫外可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1290）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 液體菌種的制備

無菌條件下，用無菌接種鏟在斜面母種處取0.5cm×0.5 cm菌種10塊，放至250 mL液體菌種培養基中，在溫度23℃、150 r/min的條件下培養3 d～4 d，待培養基中出現顆粒均勻的球狀菌絲且菌液澄清透明、無分層后停止培養，得到的菌液即為蛹蟲草液體菌種。

1.3.2 高粱、糜子和油莎豆培育蛹蟲草試驗

1.3.2.1 菌絲共生體培養

無菌條件下，將液體菌種接種于3種谷物培養基質上，接種量為2.5%（即液體種子的體積占培養料濕料質量的百分比）。接種后放入無菌栽培室中，避光培養。培養條件為溫度18℃、濕度60%。菌絲萌發后定期觀察并記錄菌絲生長情況，直至菌絲布滿整個培養基質時停止培養，此時得到的谷物培養基質和菌絲體共存的整體即為谷物蛹蟲草菌絲共生體，簡稱菌絲共生體。檢測菌絲共生體中的蟲草素含量、粗多糖含量、麥角甾醇含量和纖溶酶酶活。

1.3.2.2 子實體培養

將布滿菌絲體的培養基質繼續進行培養，培養條件為溫度20℃、濕度80%，每天通風2次，上下午各一次，每次1 h～2 h，直至子實體成熟。采摘后檢測子實體中的蟲草素含量、蟲草粗多糖含量、麥角甾醇含量和纖溶酶酶活。

1.3.3 蛹蟲草活性物質檢測

1.3.3.1 粗多糖含量的測定

粗多糖含量參照戚夢等[15]的方法進行檢測。

1.3.3.2 蟲草素含量的測定

蟲草素含量參照NY/T 2116—2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定 高效液相色譜法》中的方法進行檢測。

1.3.3.3 麥角甾醇含量的測定

麥角甾醇含量參照T/HZBX 026—2019《真菌及其制品中麥角甾醇的測定高效液相色譜法》中的方法進行檢測。

1.3.3.4 纖溶酶酶活的測定

按料液比1∶2（g/mL），在菌絲共生體、子實體中分別加入適量去離子水，4℃靜止浸提6 h，6 000 r/min離心5 min，收集上清液。參考王明瑞等[2]的方法進行纖溶酶酶活的測定。

1.4 數據處理

試驗數據的統計分析采用Excel和SPSS 20.0軟件，差異顯著性的分析采用單因素方差和最小顯著差（least significance difference test，LSD）檢驗法，顯著性水平設定為P＜0.05。作圖采用Origin 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同培養基質對蛹蟲草菌絲共生體中不同有效成分的影響

2.1.1 不同谷物培養基質對菌絲共生體粗多糖含量的影響

多糖是蟲草菌中的一種主要活性物質，其合成過程與栽培原料成分差異、蛹蟲草發育階段、細胞內物質代謝及途徑等有關[16-17]。不同培養基質對蛹蟲草菌絲共生體粗多糖含量的影響見圖1。

圖1 不同谷物培養基質對菌絲共生體粗多糖含量的影響Fig.1 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias mycelial symbiote

由圖1可知，在相同試驗條件下，不同培養基質上菌絲共生體的粗多糖含量不同，且差異顯著（P＜0.05）。其中，糜子培養基質培養的菌絲共生體中粗多糖含量最高，為72.50 mg/g；油莎豆培養基質培養出的菌絲共生體中粗多糖含量最低，為21.93 mg/g；高粱培養基質培養出的菌絲共生體中粗多糖含量為47.77 mg/g，介于糜子和油莎豆之間。常亞娜[18]通過對不同工藝條件下雜糧蛹蟲草菌質成分的分析發現，當麥仁和糙米質量比為1∶2，并添加一定量大豆勻漿液和奶粉，光照時間27 d時，多糖含量可達68.02 mg/g，低于本研究的糜子培養基質中粗多糖的含量。分析原因可能是不同培養基質所含營養成分的種類、含量不同，可供蛹蟲草菌絲生長所需的營養物質也不同，而且不同來源的菌株合成多糖的過程可能也會不同，最終導致蛹蟲草菌質蟲草粗多糖的含量各異。

2.1.2 不同谷物培養基質對蛹蟲草菌絲共生體蟲草素含量的影響

蟲草素是蛹蟲草中特有的活性成分，有良好的應用前景[18]。蟲草素的合成與蛹蟲草的生長基質密切相關。不同谷物培養基質對菌絲共生體蟲草素含量的影響見圖2。

圖2 不同谷物培養基質對菌絲共生體蟲草素含量的影響Fig.2 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias mycelial symbiote

由圖2可知，在相同培養條件下，油莎豆蛹蟲草菌絲共生體中的蟲草素含量最高，為3.93 mg/g，糜子培養基中的蟲草素含量次之，為2.24 mg/g，高粱培養基中的含量最低，為1.09 mg/g。常正姣[19]以麥仁、糙米、大豆勻漿液和奶粉為培養基質得出蟲草素含量為6.01 mg/g，略高于本研究油莎豆培養基質中蟲草素含量，分析原因可能是不同基質來源和不同菌株影響了蛹蟲草菌絲體中蟲草素的合成。

2.1.3 不同谷物培養基質對蛹蟲草菌絲共生體麥角甾醇含量的影響

影響食用菌中麥角甾醇含量的因素有很多，如遺傳因素、生長環境、生長基質、生長時間、生長階段和菌種來源等[20]。不同培養基對蛹蟲草菌絲共生體麥角甾醇含量的影響見圖3。

圖3 不同谷物培養基質對菌絲共生體麥角甾醇含量的影響Fig.3 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias mycelial symbiote

由圖3可知，在相同栽培條件下，菌絲共生體中的麥角甾醇含量受接種培養基質的影響，且差異顯著（P＜0.05）。油莎豆蛹蟲草菌絲共生體的麥角甾醇含量最低，為0.39 mg/g，其次是糜子，為0.76 mg/g，在高粱培養基質中含量最高可達1.38 mg/g，是油莎豆的3.54倍，推測可能是因為高粱的組成成分與糜子、油莎豆的成分不一致。

2.1.4 不同谷物培養基質對蛹蟲草菌絲共生體纖溶酶酶活的影響

不同培養基對蛹蟲草菌絲共生體纖溶酶酶活的影響見圖4。

圖4 不同谷物培養基質對菌絲共生體纖溶酶酶活的影響Fig.4 Effects of different medium fibrinolyti enzyme activity of C.militias mycelial symbiote

由圖4可知，高粱和糜子培養基質中菌絲共生體的纖溶酶酶活分別為108.42 U/g和95.81 U/g，在油莎豆培養基質中最高，可達312.26 U/g，分別為高粱和糜子的2.88倍和3.26倍，這可能是因為油莎豆粒徑大，加大了與空氣的接觸面積，有效增加了發酵界面，有利于培養基質的有效利用，促進了纖溶酶的產生。

2.2 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體不同有效成分的影響

2.2.1 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響

多糖是評價蟲草產品優良的一個重要指標[21]，蛹蟲草子實體中合成多糖的能力因培養基的不同而不同。不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響見圖5。

圖5 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響Fig.5 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias fruiting bodies

由圖5可知，油莎豆培養基質上合成粗多糖的能力顯著高于糜子和高粱培養基質，粗多糖含量分別為糜子和高粱培養基質的1.82倍和2.96倍。研究發現，3種谷物培養基質中，蛹蟲草子實體中的粗多糖含量均比菌絲共生體中的含量低。因此，糜子蛹蟲草菌絲共生體粗多糖具有良好的開發和應用潛力，可用于普通人群或特殊人群的膳食替代。本結果與常亞娜[18]的研究觀點基本一致。

2.2.2 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響

不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響見圖6。

圖6 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響Fig.6 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias fruiting bodies

由圖6可知，油莎豆培養基質的蟲草素含量最高，為7.34 mg/g，糜子培養基質次之，為5.45 mg/g，高粱培養基質最低，為4.33 mg/g，但均高于相應培養基質上的菌絲體中蟲草素含量。樂昕等[22]研究高粱米作為培養基質的蛹蟲草子實體中，蟲草素含量為2.482 mg/g，低于本研究中蟲草素的含量，推測不同的菌種和培養條件可能會導致蛹蟲草子實體蟲草素含量上的差異。研究表明，子實體中蟲草素含量高于谷物蛹蟲草菌絲共生體，因此選擇油莎豆培養基質培養子實體體更有利于蟲草素的合成。

2.2.3 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響

不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響見圖7。

圖7 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響Fig.7 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias fruiting bodies

由圖7可知，高粱培養基質上培養的子實體中的麥角甾醇含量最高，油莎豆最低，二者相差3.25 mg/g。子實體中麥角甾醇含量均高于相應培養基質上的菌絲共生體中麥角甾醇含量。結果表明，高粱培養基質培養子實體最有利于麥角甾醇的合成。

2.2.4 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響

不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響見圖8。

圖8 不同谷物培養基質對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響Fig.8 Effects of different medium on fibrinolyti enzyme activity of C.militias fruiting bodies

由圖8可知，油莎豆培養基質最有利于產纖溶酶，酶活可達140.1 U/g，其次為糜子培養基質，然后是高粱培養基質。相比菌絲共生體產纖溶酶的能力，油莎豆培養基質降低了55.13%，高粱培養基質降低了32.18%，而糜子培養基質僅降低了5.49%。研究表明，菌絲共生體中纖溶酶酶活高于子實體，油莎豆蛹蟲草菌絲共生體更有利于纖溶酶的產生。

3 結論

本研究將液體菌種分別接至高粱、糜子、油莎豆3種谷物栽培培養基質中，培育蛹蟲草產品，研究不同階段的指標特征。結果表明，不同培養基質對蛹蟲草菌絲共生體和子實體的粗多糖、蟲草素、麥角甾醇和纖溶酶酶活均有影響。高粱培養基質培養蛹蟲草子實體麥角甾醇含量最高，為6.10 mg/g，是菌絲共生體的4.42倍；糜子培養基質培養的菌絲共生體粗多糖含量最高，為72.50 mg/g；油莎豆培養基質中菌絲共生體產纖溶酶酶活最高，為312.26 U/g，子實體蟲草素含量最高，為7.34 mg/g。因此，高粱適合作為培養高產麥角甾醇的蛹蟲草子實體的培養基質，糜子可作為培養高產粗多糖的菌絲共生體的培養基質，油莎豆可作為高產蟲草素的子實體和高產纖溶酶的菌絲共生體的培養基質。

總之，蛹蟲草的各種活性成分與所用培養基質、菌株來源等多種因素相關。選擇適宜的培養基質，培養含有特定有效成分的蛹蟲草產品，可為開發多種具有不同主體功能的谷物蛹蟲草食品提供依據。