不凍液凍結對白斑狗魚凍融穩定性的影響

蘇日耶姆·尼加提，魏亞博，鄧小蓉，郭欣，雷用東，張建

石河子大學食品學院（石河子 832000）

白斑狗魚（Esox lucius），在我國主要分布于新疆阿勒泰地區額爾齊斯河流域[1]，具有肉厚刺少、營養價值高等特點。近年來，我國冷鮮魚消費比例逐漸增大，白斑狗魚由于受到地域性限制，其發展受到很大阻礙[2-3]。水產品貯藏過程中，因外界溫度變化和冷藏鏈間斷等原因，水產品在被消費前處于反復凍融狀態[4]，導致魚肉組織中的冰晶重結晶，蛋白質變性，從而影響其結構和功能，對水產品市場發展造成極大阻礙[5]。有研究表明，鮰魚、蝦等水產品貯藏過程中，反復凍融導致其肌肉質地劣變、水分流失嚴重，降低了消費者可接受的程度[6-7]。因此，研究新型凍結方式、提高白斑狗魚貯藏過程中凍融穩定性具有重要意義。

不凍液凍結法是水產品凍結領域中的新型凍結方法。不凍液也被稱為低溫載冷劑，具有冷凍速度快、能耗低、冷凍質量好等優勢[8]，通過與冷凍食品接觸換熱，從而使食品降溫達到凍結效果[9]。目前有關不凍液凍結白斑狗魚的研究較少。為適應當前白斑狗魚市場需求、提高新疆特色冷水魚經濟效益，試驗以新疆特色冷水魚白斑狗魚為研究對象，研究不同凍結點的不凍液（-39，-48，-57和-63 ℃）對白斑狗魚凍融穩定性的影響，旨在提高白斑狗魚的凍融穩定性，以期為促進白斑狗魚市場發展提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

白斑狗魚（單個體質量1 300～1 500 g，石河子市農貿市場）。

蘇木素-伊紅染液、牛血清蛋白標準品（北京索萊寶科技有限公司）；其他所有試劑均為國產分析純。

不凍液組成（所用原料均為食品級）：1號不凍液，0.15 g/mL乙醇+0.12 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.03 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結點為-39 ℃）；2號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.12 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.05 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結點為-48 ℃）；3號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.10 g/mL低聚果糖+0.04 g/mL檸檬酸+0.07 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結點為-57 ℃）；4號不凍液，0.20 g/mL乙醇+0.10 g/mL低聚果糖+0.03 g/mL檸檬酸+0.05 g/mL氯化鈣+0.10 g/mL丙二醇，其余為水（凍結點為-63 ℃）。

1.2 儀器與設備

KD-3000低溫恒冷切片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；DC-2015低溫恒溫槽（上海習仁科學儀器有限公司）；K3 Plus酶標儀（上海珂淮儀器有限公司）；CX21顯微鏡[奧林巴斯（深圳）工業有限公司]；H2500R-2高速冷凍離心機（北京澎昆博遠科貿發展有限責任公司）；TA.XT Plus質構儀（英國Stable Micro System公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

將白斑狗魚敲暈致死，去頭、尾、內臟，用流動水洗去表面的雜物，去皮、脊骨，用刀將魚脊背肌肉分割成長寬各為4 cm、厚度為2 cm的肉塊，真空包裝后放置備用。

1.3.2 樣品凍結凍藏處理

不凍液處理組：將配好的不凍液分別預冷至-20℃，將包裝好的魚塊放置于不凍液中進行凍結?？諝鈨鼋Y組：另取包裝好的魚塊放置于-20 ℃的冰箱中進行凍結。凍結期間測定魚塊中心溫度，待魚塊中心溫度達到-18 ℃時取出不凍液凍結組魚塊，放置于-20℃冰箱中凍藏，間隔5 d取1次樣進行冷凍切片及顯微觀察，并將樣品在4 ℃環境中進行解凍，待樣品溫度達到0～2 ℃時進行相關指標的測定。

1.3.3 凍結曲線的測定

將中心溫度計探頭插入魚塊幾何中心位置，另一端連接電腦，將備好的魚塊放置于預冷好的不凍液中，不凍液凍結組每隔30 s記錄1次溫度，空氣凍結組每隔5 min記錄1次溫度繪制凍結曲線。

1.3.4 冷凍切片

對冷凍切片機進行預冷處理，設置冷凍切片機冷凍室及冷動臺溫度-30 ℃。取5種不同凍結處理后的樣品，盡快修成長寬各為2 cm，厚度為1 cm，將修整好的樣品放置于樣品托并進行凍固。設置修片厚度（15 μm）并對樣品進行修片處理，待樣品表面修整為平整表面后對樣品進行切片，切片厚度為10 μm。用載玻片貼取切片，在固定液中進行固定并用蘇木素-伊紅染色液進行染色，使用光學顯微鏡對切片組織進行觀察。

1.3.5 色澤

取5種解凍后的魚肉樣品，為防止魚肉表面的水分對光的反射從而影響色澤，用濾紙將魚肉表面的水分吸干。以儀器白板色澤為標準，使用CIELAB表色系統進行色澤測定。將待測樣品放在探測器端面，每個樣品測3次。

1.3.6 汁液流失率

汁液流失率的測定方法參考聶小寶等[10]方法并略加改動。將樣品在解凍前和解凍后稱其質量，分別得到解凍前的質量（M1）和解凍后質量（M2），汁液流失率按照式（1）計算。

式中：M1為解凍前的質量，g；M2為解凍后的質量，g。

1.3.7 肌原纖維蛋白的提取及測定

白斑狗魚肌原纖維的測定參考Deng等[11]的方法進行。在解凍后的白斑狗魚中加入10倍體積的磷酸鹽緩沖溶液A（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，pH 7.5），均質勻漿直至肌肉破碎，在8 000 r/min、15 min、4 ℃條件下提取2次，棄去上清液，在沉淀中加入10倍體積的磷酸鹽緩沖溶液B（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，0.6 mol/L NaCl，pH 7.5），均質1 min，在8 000 r/min、15 min、4 ℃條件下提取2次，合并2次上清液，即為肌原纖維蛋白。采用雙縮脲法[12]測定蛋白質的濃度，以牛血清蛋白為標準品，測定標準曲線y=0.026 3x+0.003 6，R2=0.999 3。

1.3.8 總巰基含量的測定

總巰基含量的測定參考Simplicio等[13]的方法并略加改動。取5種蛋白樣品溶液，各1 mL，加入8 mL三羥甲基氨基甲烷（Tris）-甘氨酸（pH 8），渦旋混勻1 min，按4 ℃、8 000 r/min離心15 min，在溶液中加入0.5 mL 10 mmol/L Ellman 試劑（DTNB試劑），反應0.5 h后，在412 nm處測定吸光度，使用摩爾消光系數13 600 L/（mol·cm），利用式（2）計算總巰基含量（nmol/mg）。

式中：1.36×104為摩爾吸光系數，L/（mol·cm）；ρ為雙縮脲法測得的蛋白質量濃度，mg/L。

1.3.9 表面疏水性的測定

表面疏水性的測定參考Chelh等[14]的方法并略加改動。將蛋白濃度稀釋至5 mg/mL，取2 mL稀釋后的蛋白溶液加入200 μL 1 mg/mL的溴酚藍，渦旋混勻10 min，按8 000 r/min離心15 min，取上清液在595 nm下測定吸光度，記作A595nm。溴酚藍空白樣是用1 mL 20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）加200 μL溴酚藍，磷酸鹽緩沖液作空白樣，在595 nm下測定吸光度，記作A0。表面疏水性（溴酚藍，μg）按式（3）計算。

1.3.10 數據分析

數據處理和差異顯著性分析分別采用Origin和SPSS軟件進行，所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同凍結條件下白斑狗魚塊的凍結曲線

不同凍結條件下白斑狗魚塊的中心溫度變化如圖1所示。白斑狗魚塊的凍結過程分為3個階段：初階段為冷卻過程，魚塊溫度從原始溫度降低至凍結點，該階段具有降溫快的特點；中階段為結冰過程，此過程中魚塊中大部分水結成冰，放出大量潛熱，因此降溫緩慢；終階段為繼續凍結的過程，降溫速率較快[15]。比較不同凍結條件下白斑狗魚塊的凍結速率可發現，不凍液凍結速率明顯高于空氣凍結速率，并且在同一溫度下，當不凍液的凍結點越低時，其凍結速率越快。

圖1 不同凍結條件下白斑狗魚塊中心溫度變化

2.2 不同條件凍藏過程中白斑狗魚塊的冰晶形態

水產品在凍藏過程中，隨著凍藏時間的延長及凍融次數的增加，其微觀結構的完整性會發生變化，并且凍結過程中形成的冰晶大小和數量在很大程度上影響水產品的品質[16]。圖2為凍藏過程中不同凍結條件下白斑狗魚塊橫切面，可以通過冰晶留下的間隙反映魚塊中冰晶的大小。通過對比凍融0～5次期間5組魚塊中的冰晶大小可知，隨著凍融次數的增加，魚塊中的冰晶逐漸增大，且其微觀結構的完整性逐漸降低。相比于不凍液凍結組，空氣凍結組魚塊中的冰晶大，組織結構的破壞程度高，凍融5次后魚肉中纖維組織嚴重斷裂。

圖2 不同凍結條件下白斑狗魚塊的冰晶形態變化（×80）

對比4種不凍液處理組魚塊凍融后的微觀結構可知，不凍液凍結點對白斑狗魚貯藏過程中魚塊內的冰晶大小及纖維結構完整性有顯著影響。1號和2號不凍液處理組魚塊中的冰晶體積大且纖維結構破損程度嚴重，其中1號不凍液處理組魚塊在凍融5次后冰晶體積最大。3號和4號不凍液處理組魚塊在凍融0次時冰晶體積小且分布均勻，隨著凍融次數的增加，魚塊內冰晶體積逐漸增大，凍融2次時，3號不凍液處理組魚塊內冰晶體積顯著大于4號不凍液處理組魚塊。凍融5次完成后，4號不凍液處理組魚塊內冰晶體積最小且結構完整性最高。這可能是因為魚塊在凍結過程中體內液體形成的冰晶會對細胞結構造成機械性損傷，并且反復凍融過程導致魚塊內的冰晶重結晶，這對其結構造成進一步損傷。

2.3 不同條件凍藏過程中白斑狗魚塊色澤的變化

魚肉在貯藏過程中因發生一系列生化反應，會導致色澤變化[17]。不凍液凍結對白斑狗魚凍融循環過程中色澤的影響如圖3所示。隨著凍融次數的增加，不同處理組魚肉的L值出現逐漸下降趨勢，而a值和b值逐漸增加。這可能是由于貯藏過程中凍融循環促使魚肉中脂肪氧化，其產生深色物質導致魚肉表面逐漸暗淡。姜晴晴等[18]研究帶魚凍融循環過程中色澤變化也得到相似結果。

圖3 不凍液凍結對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中色澤的影響

與空氣凍結組相比，不凍液凍結組魚塊L值偏高，說明不凍液凍結處理能有效減緩白斑狗魚在貯藏過程中因凍融循環導致的色澤暗淡。不凍液凍結點對魚塊色澤有顯著影響，4號不凍液處理組魚塊L值顯著高于其他處理組，1號不凍液處理組魚塊L值最低，與空氣凍結組魚塊L值較為接近。a值與b值則與不凍液凍結點呈正相關趨勢，4組不凍液處理組中1號和2號不凍液處理組魚塊a值顯著高于其他處理組，4號不凍液處理組魚塊a值上升趨勢較為緩慢。這可能是因為凍融循環過程中凍結速率越快，魚肉脂肪氧化程度越低，魚塊在貯藏過程中色澤變化程度越低。

2.4 不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中汁液流失率的影響

不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中汁液流失率的影響如圖4所示。隨著凍融次數的增加，魚塊汁液流失率逐漸增加。這是因為在反復凍融過程中，魚塊中的細胞結構遭到破壞，肌原纖維脫水，導致蛋白質的變性，魚塊在解凍時水分流失逐漸增大。常海軍等[19]研究凍融次數對豬肉品質的影響時也得到一致結果。

圖4 不凍液凍結對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中汁液流失率的影響

凍融貯藏期間，空氣凍結組魚塊汁液流失率顯著高于不凍液處理組，說明不凍液凍結處理可在一定程度上降低白斑狗魚解凍后的汁液流失率。不凍液凍結點對魚塊汁液流失率有顯著影響，不凍液凍結點越高，魚塊汁液流失率上升趨勢越明顯，4號不凍液處理組魚塊汁液流失率顯著低于其它處理組。

2.5 不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中總巰基含量的影響

魚塊凍結過程中形成的冰晶，導致肌原纖維蛋白結構的改變，從而促使內部的巰基暴露，進而氧化為二硫鍵，因此巰基的含量可作為衡量蛋白質變性的重要指標之一[20]。不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中總巰基含量的影響如圖5所示。隨著凍融次數的增加，魚塊內總巰基含量整體呈現逐漸下降趨勢，說明隨著凍融次數的增加，魚塊內蛋白質變性逐漸增強。Zhang等[21]通過試驗證實凍融循環促進鳙魚肉中總巰基含量下降。

圖5 不凍液凍結對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中總巰基含量的影響

凍融貯藏過程中，空氣凍結組魚塊總巰基含量顯著低于不凍液凍結組，且不凍液凍結點顯著影響總巰基含量變化。凍融期間，4號不凍液凍結組魚塊總巰基含量顯著高于其他處理組，其蛋白質變性程度最低。原因可能是凍結速率快，形成的冰晶小，且在細胞內與細胞間隙中均勻分布，蛋白冷凍變形程度低[22]。

2.6 不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中表面疏水性的影響

圖6表示不凍液對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中表面疏水性的影響。隨著凍融次數的增加，表面疏水性呈現上升趨勢，且經4次凍融后魚塊表面疏水性增長迅速，說明隨著凍融次數增加，蛋白質變性程度逐漸增強。Zhang等[23]和袁麗等[24]在鰱魚和凡納濱對蝦中發現相似的研究結果。這可能是因為反復凍融過程中，蛋白質變性導致內部疏水性基團暴露，促使蛋白質二級結構肽鏈的卷曲或三級結構發生變化，蛋白質表面疏水性增強。

圖6 不凍液凍結對白斑狗魚凍融循環貯藏過程中表面疏水性的影響

凍融貯藏期間，空氣凍結組魚塊表面疏水性顯著高于其他處理組，蛋白質變性程度最高。不凍液凍結點越低，魚塊表面疏水性越低，4種不凍液處理組魚塊表面疏水性呈下降趨勢。3號和4號不凍液處理組魚塊表面疏水性較低，隨凍融次數的增加其表面疏水性增長趨勢顯著低于其他處理組，蛋白質變性程度較低。

3 結論

不凍液凍結對白斑狗魚的凍融穩定性有顯著影響。凍融貯藏期間，凍結點為-63 ℃的4號不凍液凍結組魚塊內冰晶體積顯著小于其他處理組。與空氣凍結組相比，不凍液凍結處理可在一定程度上抑制反復凍融導致魚塊的色澤、汁液流失率發生不同程度的劣化，其中4號不凍液凍結組魚塊色澤明亮，汁液流失率最低。不凍液凍結點對魚塊貯藏過程中蛋白質變性程度有顯著影響，不凍液凍結點越低，魚塊中蛋白質變性程度越低。因此，不凍液凍結更有利于保證白斑狗魚的凍融穩定性，4號不凍液（凍結點為-63 ℃）凍結速率快，魚塊品質最佳，可最大程度減少貯藏過程中反復凍融對白斑狗魚品質的影響。